一、實(shí)驗(yàn)原理與意義

免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通

過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新

技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見(jiàn)性巧妙地結(jié)合起來(lái)，借助顯微鏡(包括熒

光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋

白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。 

（一）、儀器設(shè)備
1. 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐.
2. 水浴鍋
（二）、試 劑
1. PBS緩沖液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.
2．0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,ph6.0,1000ml）：檸檬酸三鈉3g,檸檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA緩沖液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH調(diào)至ph8.0,

加水至1000ml.
4. 1mol/L的TBS緩沖液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至pH8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制
7. 風(fēng)裱劑：a.甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制
8．TBS/PBS PH9.0–9.5,適用于熒光纖維鏡標(biāo)本;ph7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本

（三）、操作流程
1、脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
a 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘
b 無(wú)水乙醇中浸泡五分鐘
c 95%乙醇中浸泡五分鐘
d 75%乙醇中浸泡五分鐘

2、抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：
A 抗原熱修復(fù)
a 高壓熱修復(fù) 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（ph6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。

將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門(mén)將會(huì)升起來(lái)。

10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門(mén)沉下去后打開(kāi)蓋子。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。

b 沸熱修復(fù) 電爐或水浴鍋加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。

c 微波爐加熱 在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，

反復(fù)1-2次。適用的抗原： Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin. ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等
B 酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃，消化時(shí)間約為5-30分鐘。適用

于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等

3、免疫組化染色SP法
（1） 脫蠟、水化
（2）PBS洗2-3次各5分鐘
（3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘
（4）PBS洗2-3次各5分鐘
（5）抗原修復(fù)
（6）PBS洗2-3次各5分鐘
（7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體
（8）滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時(shí)或4℃過(guò)夜或37℃1小時(shí)
（9）4℃過(guò)夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘
（10）PBS洗3次每次2分鐘
（11）滴加Ⅱ抗45-50μl,室溫靜置或37℃1小時(shí)
（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的 tween-20.
（13）PBS洗3次各5分鐘
（14）DAB顯色5-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度
（15）PBS或自來(lái)水沖洗10分鐘
（16）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化
（17）自來(lái)水沖洗10-15分鐘
（18）脫水、透明、封片、鏡檢。

4、SABC法
（1） 脫蠟、水化
（2）PBS洗2次各5分鐘
（3）用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次
（4）抗原修復(fù)
（5） PBS洗5分鐘

（6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體

（7）滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時(shí)或4℃過(guò)夜或37℃1小時(shí)

（8）PBS洗3次各2分鐘
（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘
（10）PBS洗3次各2分鐘
（11）滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘
（12） PBS洗4次各5分鐘
（13） DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色
（14）脫水、透明、封片、鏡檢