活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染色試劑盒 

CALCEIN-AM/PI LIVE/DEAD CELL DOUBLE STAIN KIT（NBS2015）

活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染色試劑盒 Calcein-AM/PI Live/Dead Cell Double Stain Kit是一種非常便捷的基于Calcein-AM (鈣黃綠素)和PI (碘化丙啶)雙熒光染色法檢測動物細(xì)胞死活的試劑盒，熒光染色和檢測僅需約30分鐘。染色30分鐘后就可進(jìn)行后續(xù)的熒光顯微鏡拍照、流式分析或者熒光酶標(biāo)儀定量等熒光檢測和分析。本試劑盒的原理是兩種探針可分別檢測細(xì)胞內(nèi)酯酶活性和細(xì)胞膜完整性，從而反映細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性。其中Calcein AM染色活細(xì)胞，呈現(xiàn)綠色熒光；而碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色死細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。本試劑盒用于檢測動物細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性效果參考圖1。

圖1. 活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染色試劑盒 Calcein-AM/PI Live/Dead Cell Double Stain Kit用于HT-29(人結(jié)腸癌細(xì)胞)細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測的效果圖。HT-29細(xì)胞在明場視野下仔細(xì)觀察可以看到有明顯的壞死細(xì)胞(圖A)；綠色熒光標(biāo)記的即為Calcein染色的活細(xì)胞(圖B)，紅色熒光標(biāo)記的即為PI染色的死細(xì)胞(圖C)；Calcein和PI雙染疊加(merge)后可以非常清晰地觀察到活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光染色差別(圖D)。在本實驗中，HT-29細(xì)胞經(jīng)TSZ處理4小時。TSZ為TNFα、SM-164和Z-VAD-FMK組成的細(xì)胞程序性壞死誘導(dǎo)試劑。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

Calcein AM (Calcein Acetoxymethyl Ester，中文名稱為鈣黃綠素AM或鈣黃綠素乙酰氧基甲酯)，是一種可以對活細(xì)胞進(jìn)行熒光染色的細(xì)胞染色試劑，Calcein AM是在Calcein (鈣黃綠素)的基礎(chǔ)上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基團(tuán)，加強(qiáng)了疏水性，因此能夠很容易穿透細(xì)胞膜。Calcein AM本身并沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被活細(xì)胞中內(nèi)源性酯酶水解生成具有強(qiáng)負(fù)電荷的不能通透細(xì)胞膜的極性分子鈣黃綠素(Calcein)，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，而Calcein可發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。由于死細(xì)胞缺乏酯酶或酯酶活性很低，Calcein AM進(jìn)入細(xì)胞后含有酯酶的活細(xì)胞可以產(chǎn)生Calcein，而死細(xì)胞不能或很少能產(chǎn)生Calcein，因此僅活細(xì)胞會被染色為強(qiáng)綠色熒光，死細(xì)胞不能被染色或者染色非常弱。核酸紅色熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)由于不能穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜，而只能染色細(xì)胞膜完整性被破壞的死細(xì)胞。因此，Calcein AM與碘化丙啶聯(lián)合使用，對活細(xì)胞和死細(xì)胞同時進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧湍苡糜诩?xì)胞活性與細(xì)胞毒性的檢測。Calcein AM水解產(chǎn)物Calcein的最大激發(fā)光波長為494nm，最大發(fā)射光波長為517nm；PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)光波長為535nm，最大發(fā)射光波長為617nm。Calcein和PI-DNA的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖2。

圖2. Calcein和PI-DNA的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

本試劑盒可以用于大多數(shù)的哺乳動物細(xì)胞的檢測。有報道稱Calcein AM也可以用于一些植物細(xì)胞如擬南芥(Arabidopsis)的根邊緣樣細(xì)胞(root border-like cells)、一些酵母如Pichia anomala和Saccharomyces cerevisiae和一些寄生蟲如Leishmania。由于一些寄生蟲細(xì)胞膜組分比較特殊的原因，Calcein AM不能進(jìn)入相應(yīng)的活細(xì)胞，但可以進(jìn)入凋亡早期的寄生蟲細(xì)胞，從而與PI聯(lián)用可以用于檢測凋亡早期的寄生蟲細(xì)胞。由于真菌和細(xì)菌有細(xì)胞壁，會阻礙Calcein進(jìn)入細(xì)胞，因此Calcein AM不適合用于真菌和細(xì)菌。本試劑盒與類似用途的臺盼藍(lán)染色液相比，更快捷且靈敏度更高。

本試劑盒提供的Calcein AM和PI為1000X溶液，使用非常便捷。并且這兩種溶液都經(jīng)過優(yōu)化，對大多數(shù)細(xì)胞都適用，但為得到比較理想的結(jié)果，也可根據(jù)細(xì)胞類型和實驗實際情況對Calcein AM或PI在500-2000稀釋倍數(shù)之間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。同時，本試劑盒提供了檢測緩沖液，該緩沖液可在一段時間內(nèi)維持細(xì)胞的正常狀態(tài)，并給細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)，效果比PBS或HBSS更好。對于96孔板，按推薦稀釋倍數(shù)配制相關(guān)檢測試劑，且每孔使用100μl，此時本試劑盒的小包裝、中包裝和大包裝分別可以檢測100次、500次和2500次。

保存條件：

-20℃保存，一年有效。

Calcein AM (1000X)和PI (1000X)需要避光保存。

       注意事項：

     熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

     Calcein AM (1000X)在潮濕環(huán)境中容易分解，首次使用時建議適當(dāng)分裝并-20℃密封保存。

     由于Calcein AM在水溶液中不穩(wěn)定，Calcein AM檢測工作液須現(xiàn)配現(xiàn)用，不能配制后凍存。

     培養(yǎng)液中的血清和酚紅對Calcein AM的染色可能有一定的影響，使熒光背景增強(qiáng)，建議在加入Calcein AM檢測工作液前適當(dāng)洗滌細(xì)胞。

     本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

     為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。