雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒

Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit
 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit）是一種高效的檢測(cè)工具。它首先利用螢光素（luciferin）作為底物，檢測(cè)螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）的活性；隨后，以腸腔素（coelenterazine）作為底物，檢測(cè)海腎螢光素酶（Renilla luciferase）的活性。在加入海腎螢光素酶底物的過程中，試劑盒會(huì)同時(shí)添加一種抑制劑，用于抑制螢火蟲螢光素酶對(duì)luciferin的催化發(fā)光反應(yīng)，從而確保后續(xù)檢測(cè)僅針對(duì)海腎螢光素酶的活性，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。

螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為61 kD的蛋白質(zhì)，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，能夠催化luciferin氧化生成oxyluciferin，并在此過程中發(fā)出生物螢光（bioluminescence）。海腎螢光素酶則是一種分子量約為36 kD的蛋白質(zhì)，在氧氣存在的條件下，可以催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，同時(shí)發(fā)出生物螢光。這種生物螢光可以通過化學(xué)發(fā)光儀（luminometer）或液閃測(cè)定儀進(jìn)行精確測(cè)量。

螢火蟲螢光素酶催化luciferin發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長為560 nm，而海腎螢光素酶催化coelenterazine發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長為465 nm。在實(shí)際應(yīng)用中，通常將目標(biāo)基因的5′UTR（非翻譯區(qū)）或啟動(dòng)子序列克隆至螢火蟲螢光素酶基因的上游，或?qū)?′UTR克隆至其下游，通過檢測(cè)螢火蟲螢光素酶的表達(dá)量來評(píng)估啟動(dòng)子或調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。與此同時(shí)，海腎螢光素酶（Renilla Luciferase）被用作內(nèi)參，用于校正細(xì)胞數(shù)量或轉(zhuǎn)染效率的差異，從而確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

保存條件: 

-20℃保存（一年有效）

產(chǎn)品組成： 

注意：

1. 細(xì)胞裂解液、螢火蟲熒光素酶檢測(cè)緩沖液、Renilla 熒光素酶檢測(cè)緩沖液在4℃可以保存一個(gè)月，-20℃可以保存一年，-80℃可以長期保存。

2. 螢火蟲熒光素酶檢測(cè)底物、Renilla 熒光素酶檢測(cè)底物，-20℃可以保存半年，-80℃可以保存一年。

產(chǎn)品使用：

1. 細(xì)胞裂解：

根據(jù)不同的細(xì)胞培養(yǎng)板加入適量的細(xì)胞裂解液：

1) 對(duì)于貼壁細(xì)胞：吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液后用1×PBS潤洗2遍后，去除洗滌液，然后加入細(xì)胞裂解液，使裂解液完全覆蓋細(xì)胞；對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心去上清后用1×PBS潤洗2遍后離心去上清，加入細(xì)胞裂解液。

2) 于振蕩器上室溫裂解20min以裂解充分，然后10000-15000g離心3-5min，取上清用于測(cè)定。

注意：

a) 裂解產(chǎn)物可室溫保存6h，-70℃可長期存放（裂解產(chǎn)物不能反復(fù)凍融）；

b) 如果螢光素酶的表達(dá)水平較低，可以嘗試使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小為100μl；

c) 細(xì)胞裂解后可以立即測(cè)定熒光素酶，也可以先凍存，待以后再測(cè)定。凍存樣品需融解，并達(dá)到室溫后再進(jìn)行測(cè)定。

2. 工作液準(zhǔn)備

將所有組分平衡至室溫。

1) 螢火蟲螢光素酶工作液制備

a) 配置10mg/mL螢火蟲螢光素酶儲(chǔ)存液。2mg螢火蟲熒光素酶檢測(cè)底物（NBS0555-C）溶解在200μl超純水中。儲(chǔ)存液-20℃可以儲(chǔ)存6個(gè)月，反復(fù)凍融5次。

b) 工作液配置：用螢火蟲熒光素酶檢測(cè)緩沖液（NBS0555-B）按照1:50稀釋以上儲(chǔ)存液，配制成0.2mg/ml的螢火蟲螢光素酶工作液。

注意：螢火蟲螢光素酶工作液不能反復(fù)凍融超過5次，若單次實(shí)驗(yàn)用量較少，建議按單次使用量分裝成小規(guī)格。

2) Renilla熒光素酶工作液制備

a) 配置2mg/ml Renilla熒光素酶儲(chǔ)存液。400μg Renilla 熒光素酶檢測(cè)底物（NBS0555-E）溶解在200μl無水乙醇中。儲(chǔ)存液-20℃可以儲(chǔ)存3個(gè)月，反復(fù)凍融5次。

b) 工作液配置：用Renilla 熒光素酶檢測(cè)緩沖液（NBS0555-D）按照1:50稀釋以上儲(chǔ)存液，配制成0.04mg/ml的Renilla熒光素酶工作液。

3. 檢測(cè)

1) 取樣品20-100μl（如果樣品量足夠，請(qǐng)加入100μl；如果樣品量不足可適當(dāng)減少用量，但檢測(cè)孔用量需保持一致）。細(xì)胞裂解液為空白對(duì)照。

2) 加入100μl螢火蟲螢光素酶檢測(cè)液，用槍吹打均勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測(cè)定RLU（relative light unit）值。

注意：由于該發(fā)光為瞬時(shí)發(fā)光，建議加入螢火蟲螢光素酶工作液后，立即進(jìn)行檢測(cè)。

3) 加入100μl Renilla熒光素酶工作液，用槍吹打均勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測(cè)定RLU（relative light unit）值。

4. 計(jì)算

在以Renilla熒光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲熒光素酶測(cè)定得到的RLU值除以Renilla熒光素酶測(cè)定得到的RLU值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間目的報(bào)告基因的激活程度。

注意事項(xiàng)：

1. 熒光染料操作中注意避光進(jìn)行。

2. 為保證熒光素酶檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性，可以采取適當(dāng)分裝后避光保存的方法，以避免反復(fù)凍融和長時(shí)間暴露于室溫。

3. 螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑、Renilla 熒光素酶檢測(cè)試劑最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

4. 細(xì)胞裂解液及裂解時(shí)間可根據(jù)細(xì)胞量適當(dāng)增加、延長。

5. 關(guān)于檢測(cè)儀器的選擇：能夠檢測(cè)化學(xué)發(fā)光或者生物發(fā)光的儀器都可適用于此試劑盒。如果使用多功能酶標(biāo)儀，為防止各孔之間的干擾，我們推薦使用黑色酶標(biāo)板（NBH3050），并且不同實(shí)驗(yàn)組之間最好有間隔。

6. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。