注1：為得到比較理想的結(jié)果，可根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)際染色效果對(duì)Calcein AM (1000X)和PI (1000X)在500-2000稀釋倍數(shù)之間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
注2：配制好的Calcein AM/PI檢測(cè)工作液必須一次使用完畢，不能凍存。
注3：也可以用其它合適的溶液，如無(wú)血清培養(yǎng)液、HBSS或PBS 稀釋Calcein AM (1000X)。本試劑盒配套提供的檢測(cè)緩沖液可在一段時(shí)間內(nèi)維持細(xì)胞的正常狀態(tài)，并給細(xì)胞提供一定的營(yíng)養(yǎng)，效果通常比PBS或HBSS更好。

2.熒光顯微鏡檢測(cè)：

a.接種培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于96孔板等多孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿中或者細(xì)胞爬片上，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一定處理。
b.洗滌(選做)。對(duì)于貼壁細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1遍；對(duì)于懸浮細(xì)胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1遍。酚紅或血清對(duì)于本試劑盒的檢測(cè)有一定的干擾，吸除 培養(yǎng)液和PBS時(shí)最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當(dāng)體積的Calcein AM/PI檢測(cè)工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。不同的細(xì)胞最佳孵育時(shí)間有所不同，以30min作為初始孵育時(shí)間，后續(xù)可以根據(jù)實(shí)際染色效果對(duì)染色時(shí)間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測(cè)。孵育結(jié)束后，在熒光顯微鏡下觀察染色效果(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm；PI為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。對(duì)于貼壁細(xì)胞HT-29，本產(chǎn)品的熒光染色效果參考圖1。如有需要，也可進(jìn)一步進(jìn)行其它熒光的復(fù)染，例如使用Hoechst 33342活細(xì)胞染色液染色細(xì)胞核等。注意整個(gè)過(guò)程均需注意避光操作。

3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)：

a.細(xì)胞準(zhǔn)備。貼壁細(xì)胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸，并用PBS洗滌一次；懸浮細(xì)胞250-1000×g室溫離心5min，棄上清，用PBS洗滌一次。每個(gè)樣品推薦的細(xì)胞用量為106個(gè)細(xì)胞。
b.染色。對(duì)于上一步驟的106個(gè)細(xì)胞的沉淀，加入1ml Calcein AM/PI檢測(cè)工作液，重懸為單細(xì)胞懸液。37℃避光孵育30min。注：需要準(zhǔn)備好僅含緩沖液的細(xì)胞樣品用作流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)的陰性對(duì)照，該緩沖液與配制Calcein AM/PI檢測(cè)工作液的緩沖液宜保持一致。同時(shí)準(zhǔn)備兩管額外的細(xì)胞樣品，每管只加入一種染料(Calcein AM或PI)，用于流式單染的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。
c.檢測(cè)。孵育完成后，可以直接進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，也可以250-1000×g室溫離心5min沉淀細(xì)胞，吸凈液體后每個(gè)樣品加入0.5ml緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm；PI為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。如有需要，也可進(jìn)行進(jìn)一步染色，例如使用Hoechst 33342活細(xì)胞染色液染色細(xì)胞核等。注意整個(gè)過(guò)程均需注意避光操作。染色后，將樣品置于冰上，并盡量在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析。
注1：使用僅含檢測(cè)緩沖液的并且未經(jīng)染色的細(xì)胞樣品用于流式細(xì)胞儀的陰性對(duì)照設(shè)置。
注2：細(xì)胞圈門(mén)(gate)時(shí)，注意不要圈入細(xì)胞碎片，并使用Calcein AM或PI單染的細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)補(bǔ)償。雙染細(xì)胞流式檢測(cè)應(yīng)獲得兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的細(xì)胞群：綠色熒光的活細(xì)胞群和紅色熒光的死細(xì)胞群。
注3：由于流式檢測(cè)比較靈敏，使用的熒光探針濃度可能要比熒光顯微鏡檢測(cè)時(shí)要低，此時(shí)可根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)際染色情況對(duì)Calcein AM或PI的稀釋倍數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

4.熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞死活的變化：

a.接種培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于96孔板黑色多孔板中，如B全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔的細(xì)胞數(shù)需要控制在100-10,000個(gè)，通常宜在2000-5000個(gè)范圍內(nèi)。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一定處理。
b.洗滌(選做)。對(duì)于貼壁細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1遍；對(duì)于懸浮細(xì)胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1遍。酚紅或血清對(duì)于本試劑盒的檢測(cè)有一定的干擾，吸除培養(yǎng)液和PBS時(shí)最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當(dāng)體積的Calcein AM/PI檢測(cè)工作液，通常96孔板每孔加入100μl。37℃避光孵育30min。不同的細(xì)胞最佳孵育時(shí)間有所不同，以30min作為初始孵育時(shí)間，后續(xù)可以根據(jù)實(shí)際染色效果對(duì)染色時(shí)間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測(cè)。孵育結(jié)束后，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm；PI為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。通過(guò)對(duì)比對(duì)照組與處理組的RFU (Relative fluorescence values)，可以得出死細(xì)胞與活細(xì)胞數(shù)量的變化。

5.熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞死活的比例：本方法通過(guò)設(shè)置對(duì)照，可計(jì)算出死細(xì)胞與活細(xì)胞的比例。

a.細(xì)胞培養(yǎng)和處理同前。
b.除配制Calcein AM/PI檢測(cè)工作液外，還需要配制單獨(dú)的Calcein AM檢測(cè)工作液和PI檢測(cè)工作液用于對(duì)照的檢測(cè)。配制方法和稀釋倍數(shù)與Calcein AM/PI檢測(cè)工作液的配制一致。
c.檢測(cè)樣品組和對(duì)照組設(shè)置：
對(duì)于下面組別的細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞組，需要保持細(xì)胞數(shù)量、檢測(cè)工作液濃度、孵育時(shí)間和孵育溫度的完全一致。

活細(xì)胞組為沒(méi)有加入藥物處理的細(xì)胞；死細(xì)胞組可用0.1-0.5%洋地黃皂苷或0.1%皂素處理細(xì)胞10分鐘，或70%乙醇孵育細(xì)胞30分鐘即可得到死細(xì)胞。
d.染色和檢測(cè)步驟同前。
e.根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)算死細(xì)胞與活細(xì)胞的比例：
% Live Cells =F(517)_sam-F(517)_min
F(517)_max-F(517)_min×100%
% Dead Cells =F(617)_sam-F(617)_min

                        F(617)_max-F(617)_min×100%

注1：其中所有的F(517)和F(617)都減去相應(yīng)的F(517)₀和F(617)₀。

注2：如果需要確定活細(xì)胞與死細(xì)胞的具體數(shù)量，可制作不同數(shù)量活細(xì)胞與死細(xì)胞在517nm和617nm處的熒光光譜標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性關(guān)系，因此通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品中兩個(gè)染料的熒光強(qiáng)度可計(jì)算出活細(xì)胞與死細(xì)胞的數(shù)量。