Propidium Monoazide (PMA) 疊氮溴化丙錠

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

疊氮溴化丙錠（Propidium Monoazide，PMA）是一種光反應(yīng)的DNA結(jié)合染料，用于微生物（比如：細(xì)菌、病毒和真菌）的活力PCR（v-PCR）分析。作為一種DNA修飾劑和光反應(yīng)染料，PMA高親和結(jié)合DNA。經(jīng)可見光刺激發(fā)生光裂解后，PMA共價(jià)吸附到DNA上，這一改性的DNA不能被PCR擴(kuò)增。PMA染料不具細(xì)胞膜滲透性，因此，在含活死細(xì)胞的群體內(nèi)，只有死細(xì)胞對(duì)DNA修飾劑敏感，由于具受損的細(xì)胞膜。PMA染料的這一特性，使其高度適合通過qPCR的手段來選擇性檢測(cè)活細(xì)菌（見Fig 1. PMA的作用機(jī)理）。

Fig 1. PMA的作用機(jī)理示意圖。細(xì)胞膜非滲透性染料-PMA選擇性和共價(jià)修飾死細(xì)菌（具受損細(xì)胞膜）來源的DNA，而活細(xì)菌來源的DNA保持不變。由于PMA修飾的DNA不能擴(kuò)增（這一產(chǎn)物抑制PCR聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)），因此，后續(xù)的qPCR能選擇性定量活細(xì)菌。

疊氮溴化丙錠（Propidium Monoazide，PMA）具有以下特征：①利用qPCR技術(shù)選擇性檢測(cè)活細(xì)胞；②死細(xì)胞特異性染料，結(jié)合到DNA上；③光活化后共價(jià)交聯(lián)到DNA上；④適用于多種樣本類型包括：細(xì)菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核細(xì)胞；能應(yīng)用在食品和水安全和環(huán)境測(cè)試，能與qPCR、NGS、Sanger測(cè)序和LAMP技術(shù)結(jié)合使用。

產(chǎn)品特性：

1） 分子量：511 g/mol
2） 外觀：深紅色固體
3） Abs：464nm（光裂解前）
4） Abs/Em：510/610nm（光激活后交聯(lián)到核酸上）
5） 溶解性：溶于DMSO、DMF、H₂O（20mM）

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

產(chǎn)品使用：

1. 活力PCR（v-PCR）實(shí)驗(yàn)前考慮事項(xiàng)

1.1 活力PCR基于細(xì)胞膜滲透性來區(qū)分活細(xì)胞和無活力細(xì)胞。許多殺死細(xì)胞的方法都會(huì)引起受損細(xì)胞膜，從而適用于活力PCR分析。但是，某些方法比如紫外曝光，不會(huì)立即引起破損的細(xì)胞膜。文獻(xiàn)搜索和預(yù)實(shí)驗(yàn)有助于確定活力PCR適用于您使用的細(xì)胞類型和處死方法。

1.2 引物選擇是重要考慮因素。如果希望同時(shí)檢測(cè)混合物中的所有細(xì)菌類型，靶向rRNA的引物（寬譜物種特異性）是很好的選擇。如果只想檢測(cè)某一種特定的細(xì)菌類型，則需設(shè)計(jì)或查找特定的引物。染料分子是隨機(jī)結(jié)合DNA雙鏈。因此，擴(kuò)增子越長(zhǎng)，染料結(jié)合到擴(kuò)增子上的可能性越高。建議擴(kuò)增子的長(zhǎng)度至少100bp，擴(kuò)增子越長(zhǎng)通常得到更好的結(jié)果。

1.3 進(jìn)行活力PCR實(shí)驗(yàn)前冰凍樣本，可能損傷細(xì)胞膜，并且給出錯(cuò)誤的陰性結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)冰凍對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的結(jié)果影響高于革蘭氏陰性菌。光照后樣本可進(jìn)行冰凍保存。

1.4 為了讓PMA共價(jià)結(jié)合到死細(xì)胞DNA上，活力PCR需先進(jìn)行光活化步驟。可以用藍(lán)色或白色光源來刺激。總的來說，光照越強(qiáng)，光活化步驟越有效。非LED光，比如：鹵素?zé)簦赡軙?huì)加熱樣品對(duì)測(cè)定產(chǎn)生負(fù)面影響。

1.5 PMA的作用方式有一部分是通過沉淀從樣本中去除PMA-結(jié)合的DNA，因此，不同樣品間每一個(gè)qPCR反應(yīng)中模板DNA的量不需要?dú)w一化。取而代之的是，使用每個(gè)樣本中洗出的等體積gDNA用于PCR反應(yīng)。作為qPCR反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照，1ng 純化的gDNA足夠產(chǎn)生良好的信號(hào)。

1.6 為了確保待測(cè)樣本的PMA有效性，最好建立活細(xì)胞和死細(xì)胞對(duì)照，每個(gè)分別設(shè)置加和不加PMA組。每一組對(duì)照因PMA引起的Ct值變化（dCt）都需測(cè)定。

2. 儲(chǔ)存液制備

將低溫保存的PMA粉末置于室溫回溫至少20min，低速離心使粉末沉至管底。避光條件下加入98μl無菌水，充分溶解混勻，即得到20mM儲(chǔ)存液。儲(chǔ)存液根據(jù)單次用量分裝，-20℃避光凍存，至少6個(gè)月有效。

3. 活力PCR操作方法

以下是用PMA檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)物的通用操作方法。建議首先對(duì)測(cè)試物種的活菌和死菌對(duì)照進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。對(duì)于復(fù)雜樣本，比如糞便或土壤，可能需優(yōu)化樣本稀釋、染料濃度和光處理時(shí)間。對(duì)于稀釋樣本，比如水樣，可能在PMA處理前需對(duì)樣本做過濾或濃縮處理。

3.1 用合適的培養(yǎng)基接種和擴(kuò)增細(xì)菌（擴(kuò)增體積依實(shí)驗(yàn)用量設(shè)置）。過夜或更長(zhǎng)時(shí)間振蕩培養(yǎng)，直至培養(yǎng)懸液OD₆₀₀接近1。

3.2 （推薦）：為了制備死菌對(duì)照樣本，于90℃處理5min使得細(xì)菌熱失活。如果想比較活力PCR與平板培養(yǎng)菌活，可以在適宜的培養(yǎng)基平板上涂布10μl熱失活的細(xì)菌，以及涂布10μl（1：100倍未處理的細(xì)菌）于另一平板上。適當(dāng)條件下培養(yǎng)觀察菌落生長(zhǎng)情況。

3.3 取400μl細(xì)菌培養(yǎng)物到一干凈的離心管。每一個(gè)樣本，需設(shè)置一管PMA處理菌，和一管非PMA處理菌（不加染料），為了計(jì)算dCt值。

3.4 室溫避光下取適量的PMA儲(chǔ)存液到管內(nèi)使其終濃度為50μM（比如：1μl 20mM儲(chǔ)存液加入400μl菌液）

3.5 室溫避光孵育10min，孵育期間可以適當(dāng)指撥混勻，也可用鋁箔紙包好置于搖床上孵育。

3.6 將樣品曝光， 可以使用藍(lán)色或白色光源， 不同的光源照射時(shí)間需自行摸索，使PMA與DNA充分交聯(lián)。例如：可用60W的藍(lán)光燈，照射15min。通常，光線越亮，效率越高。非LED光，比如：鹵素?zé)簦赡軙?huì)加熱樣品對(duì)測(cè)定產(chǎn)生負(fù)面影響。

3.7 5000g，離心10min。

3.8 使用標(biāo)準(zhǔn)方法或商業(yè)化的試劑盒抽提基因組DNA，用于后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)。

3.9 選擇特異性的引物來執(zhí)行qPCR（關(guān)于引物選擇，每一個(gè)PCR反應(yīng)確保使用相同體積的洗脫DNA）。經(jīng)PMA修飾的DNA會(huì)在qPCR反應(yīng)中表現(xiàn)出擴(kuò)增延遲效應(yīng)。

注意事項(xiàng)：

1.      熒光探針均存在淬滅問題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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