IPTG 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷

產(chǎn)品簡介：

IPTG，英文全名Isopropyl-beta-D-thiogalactoside，中文全名異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，CAS NO：367-93-1，誘導(dǎo)細(xì)菌lac或tac操縱子調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄，尤其是水解酶β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）。一旦表達(dá)，β-gal水解β-半乳糖苷和乳糖為單糖。IPTG通常用于β-gal活性分析，當(dāng)含大腸桿菌來源lacZ基因的載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，編碼表達(dá)β-gal，細(xì)胞裂解后，通過催化底物ONPG的顏色反應(yīng)即可定量分析活性。IPTG也是硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰基酶的底物，文獻(xiàn)報道還能誘導(dǎo)合成細(xì)菌青霉素酶。體內(nèi)研究IPTG的一個重要優(yōu)勢在于，IPTG不會大腸桿菌所代謝，IPTG濃度和lac p/o控制基因表達(dá)都保持穩(wěn)定。

IPTG誘導(dǎo)lacZ表達(dá)的作用機(jī)制:

1）lacZ操縱子（lacZ Operon）的概念

lac操縱子是調(diào)控大腸桿菌和其他一些細(xì)菌的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝必需的一種操縱子，包含三種緊密連接的結(jié)構(gòu)基因，lacZ，lacY和lacA。包括葡萄糖和乳糖等在內(nèi)的幾種因素都可調(diào)控lac操縱子。

2）IPTG誘導(dǎo)lacZ表達(dá)的作用機(jī)制

lacZ基因是β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）表達(dá)的一種基因。IPTG作為一種非代謝性的半乳糖類似物，與lac repressor（lac阻遏物，乳糖阻遏物）結(jié)合，以變構(gòu)形式釋放lac操作基因（lac operator）來源的四聚體阻遏物，從而允許lac操縱子上的基因轉(zhuǎn)錄，比如lacZ基因表達(dá)β-gal。克隆實(shí)驗(yàn)IPTG誘導(dǎo)lacZ基因表達(dá)。IPTG是最常用的lac操縱子合成誘導(dǎo)劑，在極低濃度有活性，且不會受酶降解的影響。

IPTG的主要生理功能:

1）β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）活性檢測

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）由大腸桿菌lacZ基因編碼，是最常用的一種報告酶，用來研究哺乳動物細(xì)胞的基因表達(dá)，蛋白-蛋白相互作用，以及標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染效率。

檢測原理：IPTG誘導(dǎo)lacZ基因表達(dá)β-半乳糖苷酶（β-gal），細(xì)胞裂解后，體系中加入無色的ONPG（鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷），被β-gal水解為鄰硝基苯酚（o-nitrophenol），生成黃色（420nm）。顏色反應(yīng)的強(qiáng)度與β-gal活性成正比。

2）藍(lán)白斑篩選（Blue-white screening）

IPTG普遍用在需要誘導(dǎo)β-gal活性的克隆步驟中，最為常見的就是和X-gal聯(lián)合使用進(jìn)行藍(lán)白斑克隆篩選，或與Magenta-gal聯(lián)合使用進(jìn)行紅/白斑克隆篩選。

作用機(jī)理：當(dāng)目的基因插入載體lacZ基因，破壞β-gal表達(dá)并阻止其表達(dá)。細(xì)菌在含X-gal的培養(yǎng)基上生長，β-gal水解此底物生成一不可溶藍(lán)色產(chǎn)物，菌落呈藍(lán)色。若β-gal不能表達(dá)，細(xì)菌克隆則無法催化X-gal底物，菌落呈白色，以此區(qū)分轉(zhuǎn)化重組載體或非重組載體的克隆子。

3）重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

IPTG也可用于重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。在這些體系中，待研究蛋白在IPTG誘導(dǎo)型啟動子下游編碼。IPTG誘導(dǎo)待研究蛋白表達(dá)，對細(xì)胞裂解后，使用一系列合適方法來純化蛋白，如His-tag或GST-tag純化系統(tǒng)（融合相應(yīng)標(biāo)簽的重組蛋白）。

IPTG產(chǎn)品特性：

1）CAS NO：367-93-1

2）英文同義名：Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; Isopropyl β-D-thiogalactoside; IPTG;

3）中文同義名：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷；

4）分子式：C9H18O5S

5）  分子量：238.30 g/mol

6）  純度：≥99%（基于干重，HPLC）

7）  外觀：白色結(jié)晶粉末

8）  雜質(zhì)：≤0.1% Dioxane（二氧六環(huán)）

9）  溶解性：溶于水、乙醇

10）化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

-20℃保存（5年有效）

產(chǎn)品使用：

1. IPTG儲存液配制

稱取0.238g IPTG溶于10ml去離子水中，充分溶解混勻后，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，即得到100mM（100×）的儲存液。按照1ml/管分裝，置于-20℃凍存，高達(dá)一年穩(wěn)定。

2. 藍(lán)白斑篩選方法

方法1：X-Gal、IPTG加入固體培養(yǎng)基（推薦）

1）高壓滅菌已加瓊脂的培養(yǎng)基，并冷卻到50℃左右；

2）每ml培養(yǎng)基內(nèi)加入10μl 20mg/ml X-gal溶液、10μl 100mM IPTG（使其終濃度達(dá)到1mM）；

3）加入適量篩選抗生素如氨芐青霉素，卡那霉素，羧芐青霉素等；

4）混勻后倒板，置于無菌超凈臺內(nèi)使培養(yǎng)基凝固（通常需要30min）。

5）將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布到上述平臺，于37℃倒置培養(yǎng)過夜，觀察藍(lán)白斑情況。

方法2：X-Gal、IPTG直接涂布平板表面

1）于無菌超凈臺內(nèi)干燥倒好的平板；

2）加120μl 20mg/ml X-gal溶液、40μl 100mM IPTG到平板表面，并涂布均勻覆蓋整個平板；

3）于無菌超凈臺內(nèi)干燥上述平板，至少需要30min；

4）將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布到上述平臺，于37℃倒置培養(yǎng)過夜，觀察藍(lán)白斑情況。

方法3：X-Gal、IPTG加入上層培養(yǎng)基（噬菌體）

1）高壓滅菌已加瓊脂（0.7%）的培養(yǎng)基，并冷卻到50℃左右；

2）每3ml培養(yǎng)基內(nèi)加入40μl 20mg/ml X-gal溶液、25μl 100mM IPTG；

3）加入細(xì)菌和噬菌體混合物，翻轉(zhuǎn)離心管使快速混勻，然后倒入上層平板鋪平。

4）于30℃培養(yǎng)過夜，觀察藍(lán)白噬菌斑情況。

3. IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)

細(xì)菌重組蛋白用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，有兩種基本方法，一種是快速誘導(dǎo)法，并非適合所有蛋白，且產(chǎn)量并非最理想。另一種是慢誘導(dǎo)法，能增強(qiáng)一些蛋白的可溶性。根據(jù)具體要求來選擇合適方法。

方法1：快速誘導(dǎo)法

1）從一個相對新鮮平板上挑取一個克隆，接種到含Amp的1-2ml LB培養(yǎng)液，裝入15ml離心管，30°C (or 37°C)于搖床培養(yǎng)過夜；

2）按照1:50（37°C培養(yǎng)1:100）的比例稀釋到2ml含Amp的LB培養(yǎng)液，裝入15ml離心管，37°C于搖床培養(yǎng)3-4h；

3）提前準(zhǔn)備1ml LB+Amp+1mM IPTG，裝入15ml離心管內(nèi)，并在使用前15min于37°C預(yù)熱；

4）從步驟2中培養(yǎng)3-4h的培養(yǎng)液中吸取1ml，裝入1.5ml離心管。室溫超速離心30s，去除上清液。將菌體沉淀物置于-20°C待用。【此為未誘導(dǎo)對照】

5）將預(yù)熱的1ml LB+Amp+1mM IPTG加到上述培養(yǎng)物中，重新置于37°C培養(yǎng)3-4h；此時培養(yǎng)總體積2ml，IPTG終濃度未0.5mM。

6）從步驟5中培養(yǎng)3-4h的培養(yǎng)液中吸取1ml，裝入1.5ml離心管。室溫超速離心30s，去除上清液。將菌體沉淀物置于-20°C凍存?！敬藶檎T導(dǎo)樣本】

7）SDS-PAGE檢測樣本：加入100ul 1X loading buffer（含1% BME）到未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)樣本中。漩渦混我10s-1min，或直至看不到細(xì)菌團(tuán)。煮沸3-5min，超速離心30s。

方法2：慢速誘導(dǎo)法

1）—4）步驟同上；

5）將20°C的1ml LB+Amp+1mM IPTG加到上述培養(yǎng)物中，重新置于20°C培養(yǎng)12-16h；此時培養(yǎng)總體積2ml，IPTG終濃度未0.5mM。

6）從步驟5中培養(yǎng)12-16h的培養(yǎng)液中吸取1ml，裝入1.5ml離心管。室溫超速離心30s，去除上清液。將菌體沉淀物置于-20°C凍存?！敬藶檎T導(dǎo)樣本】

方法3：可溶性蛋白的提取

1）用2ml冰STE（10mM Tris，pH 8.0；150mM NaCl；1mM EDTA；）洗滌細(xì)菌沉淀物一次；

2）重懸細(xì)菌沉淀物（10ml誘導(dǎo)培養(yǎng)物），用800ul含100ug/ml溶菌酶的STE；（溶菌酶必須重懸前即刻加入）；

3）冰浴15min；

4）加入DTT（貨號：NBS2006-10g）使其終濃度未5mM；

5）加入蛋白酶抑制劑（貨號：NBS0001-1ml）。

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。