G418 Sulfate (Geneticin) 遺傳霉素（凍干粉）

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

G418，又稱為G418硫酸鹽（G418 Sulfate），遺傳霉素（Geneticin），是一種氨基糖苷類抗生素，結(jié)構(gòu)上類似于慶大霉素B1（Gentamicin B1），對(duì)細(xì)菌、酵母菌、原蟲和蠕蟲、以及高等植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞都有毒性。由紅橙小單孢菌（Micromonospora rhodorangea）代謝產(chǎn)生，與核糖體結(jié)合，引起翻譯中無意義突變鏈的產(chǎn)生，最終抑制多肽合成和蛋白延伸。G418在分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中普遍用作一種篩選抗生素。對(duì)G418的抗性主要由新霉素抗性基因（neo）賦予，位于轉(zhuǎn)座子Tn601(903)（氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶3’[I]或APH 3’[I]）和Tn5（氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶3’[II]或APH 3’[II]）。這些基因源自細(xì)菌，但可在真核細(xì)胞中表達(dá)。將這些基因中的任何一個(gè)導(dǎo)入細(xì)胞均可以使細(xì)胞獲得G418抗性，從而能在含G418的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，當(dāng)抗性基因neo整合進(jìn)入真核細(xì)胞基因組，使其能編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶3’[II]（APH 3’[II]），此酶通過共價(jià)修飾G418的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細(xì)胞產(chǎn)生G418抗性。

植物細(xì)胞中，當(dāng)抗性基因nptII導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，其也能編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，從而使得多種抗生素喪失活性，包括G418，卡那霉素和巴龍霉素。

我司提供兩種形式的G418硫酸鹽，

一種以凍干粉形式提供（貨號(hào)：NBS2099-1g，NBS2099-5g），易溶于水（50mg/mL）。需過濾除菌后使用。

一種以溶于水的儲(chǔ)存液形式提供（貨號(hào)：NBS2099-20ml），無菌溶液，可直接使用。

對(duì)于基因篩選實(shí)驗(yàn)，需要建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）確定能夠殺死無抗性細(xì)胞的最低有效濃度。

產(chǎn)品特性：

1） CAS NO.：108321-42-2

2） 同義名：G-418; G418; Antibiotic G418 sulfate; G 418 disulfate salt; Geneticin; Glycoside-418, Sulfate; BRN 1669188; G418硫酸鹽；G-418硫酸鹽；G418二硫酸鹽；遺傳霉素；

3） 分子式：C20H40N4O10· 2H2SO4

4） 分子量：692.7

5） 外觀：白色至類白色粉末

6） 純度：≥98%（HPLC）

7） 活性：≥700 μg/mg（基于干重）

8） 化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

保存條件: 

凍干粉-20℃干燥保存，至少3年有效，防止受潮，否則會(huì)引起抗生素活性降低。

儲(chǔ)存液-20℃保存，至少2年有效。

產(chǎn)品使用：

一、  G418儲(chǔ)存液的制備

1.1   對(duì)于G418凍干粉（貨號(hào)：NBS2099-1g，NBS2099-5g）

1）活力單位的換算

公式：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見批次對(duì)應(yīng)的質(zhì)檢報(bào)告，或者瓶子上的標(biāo)簽。A1是想配制的G418活性濃度。A2是實(shí)際稱重的粉末與體積比濃度。

示例：若所用批次的G418 活力值為：720 μg/mg，要配制50mg/mL的G418活性濃度，則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/720×50 mg/ml=69.44 mg/mL。

如果配制10ml的G418儲(chǔ)存液（活性濃度，50 mg/ml），則需要稱取694.4mg粉末。

2）除菌和保存

根據(jù)上述換算得到的實(shí)際粉末稱重，加入10 ml去離子水內(nèi)使其完全溶解。

先用5ml去離子水預(yù)濕潤(rùn)0.22μm針頭式過濾器，除盡水。之后使用此濾器過濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1ml）放到-20℃凍存，2年穩(wěn)定。

【注意】：①不要對(duì)混濁的溶液進(jìn)行過濾，因?yàn)榛鞚岬娜芤阂馕吨赐耆芙?，過濾過程中會(huì)造成藥物損失，降低終液的活性。②不建議使用液體培養(yǎng)基，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機(jī)溶劑來制備儲(chǔ)存液。

1.2   對(duì)于G418儲(chǔ)存液（貨號(hào)：NBS2099-20ml）

本品是基于G418活性濃度配制的無菌溶液，活性濃度為50mg/mL，收到貨第一次使用，可將本品按照更小規(guī)格分裝，-20℃保存，以延長(zhǎng)本品的保存周期。若使用頻繁，可將本品置于2-8℃保存，至少1年穩(wěn)定。

二、  常用篩選濃度

一般來說，剛開始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的G418，并用一個(gè)較低濃度的G418用于維持培養(yǎng)。生長(zhǎng)條件，細(xì)胞類型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過殺滅曲線（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線，來確定最佳篩選濃度。

通常情況，哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選范圍200-2000 μg/mL；植物細(xì)胞：10-100 μg/mL；酵母細(xì)胞：500-1000 μg/mL；網(wǎng)柄菌屬：10-100μg/mL；

以下是一些細(xì)胞類型使用G418篩選使用的濃度，可做參考。

三、  殺滅曲線的建立

為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素最低濃度，可通過建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）來實(shí)現(xiàn)，至少選擇6個(gè)濃度。處理分裂期的細(xì)胞時(shí)G418的活性最強(qiáng)，因此在添加G418之前需要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間。

3.1 第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO₂培養(yǎng)過夜；【注意】：對(duì)于需要更高密度來檢測(cè)活力的細(xì)胞，可增加接種量。

3.2 根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

3.3 第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。

3.4 接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。

3.5 按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

四、  穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

4.1 轉(zhuǎn)染48h后，用含有適當(dāng)濃度的G418篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）?！咀⒁狻浚杭?xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果最好。當(dāng)細(xì)胞過于稠密，其效率會(huì)降低。為了得到較好的篩選效果，最好將細(xì)胞稀釋至豐度不超過25%。

4.2 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)基。

4.3 篩選7天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果。

4.4 挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

4.5 之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

注意事項(xiàng)：

1.      不要將G418和其他抗生素/抗真菌劑（如青霉素/鏈霉素）共同使用，因?yàn)檫@些抗生素是G418的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。其他抗生素也有可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

2.      本品以粉末形式提供，非無菌的。因此，配制的溶液需經(jīng)0.2μm濾膜過濾除菌后再使用。不可高壓滅菌。G418儲(chǔ)存液置于-20℃可穩(wěn)定保存高達(dá)24個(gè)月，或置于2-8℃穩(wěn)定保存高達(dá)6個(gè)月。

3.      配制G418溶液，一定要根據(jù)G418實(shí)際批次的活性（potency）來進(jìn)行換算，從而得到需要活性濃度的儲(chǔ)存液以及工作液。

4.      G418溶于水是呈酸性的，直接加入培養(yǎng)基通常會(huì)導(dǎo)致瞬間的pH變化，在含酚紅的培養(yǎng)基內(nèi)會(huì)看容易看到顏色變化。如果培養(yǎng)基本身具有良好的緩沖性，經(jīng)幾分鐘至數(shù)小時(shí)pH會(huì)回復(fù)到正常。如果pH變化是很看重的一個(gè)因素，可選擇用緩沖液溶液比如100mM HEPES來配制G418儲(chǔ)存液。

5.      G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會(huì)被殺死，原因在于藥物濃度過低，或者細(xì)胞密度過高。另外，快速分裂的細(xì)胞相對(duì)于緩慢增殖細(xì)胞，更容易被殺死。對(duì)照細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉(zhuǎn)染細(xì)胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

6.      即使加入殺死劑量的G418，細(xì)胞可能會(huì)繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

7.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

常用篩選抗生素及其使用濃度: