H2DCFDA (DCFH-DA) 活性氧（ROS）熒光探針

產(chǎn)品信息

【溫馨提示】：對于使用量較少且要求更簡單方便，可選擇我司提供的 活性氧（ROS）檢測試劑盒（ROS assay kit），此試劑盒不僅含熒光探針H2DCFDA，還包括陽性對照。

產(chǎn)品描述

H2DCFDA(DCFH-DA)，英文全名2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，中文全名2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯，是一種通用的氧化應(yīng)激指示劑。具細(xì)胞膜滲透性，本身無熒光。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞酯酶水解生成2',7'-二氯二氫熒光素（2',7'-Dichlorodihydrofluorescein, DCFH），之后被快速氧化生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物2',7'-二氯熒光素（2',7'-dichlorofluorescein, DCF），可用熒光光譜檢測（Ex/Em= 504/529nm）。適用于檢測活性氧（ROS）和一氧化氮（?NO），以及確定總的氧化應(yīng)激水平。普遍用來監(jiān)測細(xì)胞氧化還原過程。

本品以粉末形式提供，可直接溶于無水DMSO配制成1-10mM儲存液，常用工作濃度1-10μM，需根據(jù)自身的實驗體系或參考文獻(xiàn)進(jìn)行優(yōu)化。

產(chǎn)品特性

1）CAS NO：4091-99-0

2）化學(xué)名：Benzoic acid, 2-[3,6-bis(acetyloxy)-2,7-dichloro-9H-xanthen-9-yl]; 2-(2,7-dichloro-3,6-diacetyloxy -9H-xanthen-9-yl)-benzoic acid;

3）英文同義名：DCFH-DA;2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate; 2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate; 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate;

4）中文同義名：2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯；2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯；

5）分子式：C24H16Cl2O7

6）分子量：487.29

7）純度：≥97%

8）外觀：白色至帶黃色光澤的白色粉末

9）溶解性：溶于DMSO（25mg/ml）、DMF（25mg/ml）、無水乙醇（25mg/ml）

保存與運輸方法

保存：-20oC避光干燥保存，至少2年有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）有機(jī)溶劑如DMSO儲存液需分裝成單次用量后，-20oC避光保存，避免反復(fù)凍融。

2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法（僅作參考）

以下步驟是來源于大量文獻(xiàn)總結(jié)的簡易操作流程，僅作參考。用戶需根據(jù)特定的應(yīng)用和敏感性來做調(diào)整。

1）將低溫保存的凍干粉取出回至室溫，低速離心使粉末落到瓶底。之后加入適量無水DMSO或其他有機(jī)溶劑配制成1-10mM儲存液。未用完的DMSO儲存液需分裝并避光凍存在-20℃，避免反復(fù)凍融。

2）于正式實驗前，用生理鹽緩沖液（比如：PBS，HBSS，HEPES）稀釋到工作濃度1-10μM。需根據(jù)具體應(yīng)用來調(diào)整合適的工作濃度。

3）吸走培養(yǎng)液，加入步驟2）配制的染色工作液到細(xì)胞內(nèi)，室溫或30℃孵育5~60min。

4）吸走染色工作液，用預(yù)熱的生理緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液清洗一遍。重新加入預(yù)熱的生理緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液，在適宜溫度內(nèi)孵育。對于二乙酸酯衍生物，需要短暫復(fù)原時間讓細(xì)胞內(nèi)酯酶將其水解，從而讓染料對氧化應(yīng)激產(chǎn)生反應(yīng)。最佳的復(fù)原時間范圍很廣，由于某些細(xì)胞類型通常顯示極其低水平的酯酶活性。

5）將細(xì)胞暴露于實驗刺激物之前，先測定加載細(xì)胞的背景熒光強(qiáng)度。

6）根據(jù)以下情況評估陰性對照（Negative control），

6.1 綠色發(fā)射光譜內(nèi)檢查未染色細(xì)胞的自熒光情況。

6.2 對于流式分析，查明染料加載和處理后細(xì)胞的前向角散射和側(cè)向角散射是不變。細(xì)胞尺寸的變化可能與起泡或萎縮有關(guān)，由于處理或有毒反應(yīng)引起的。

6.3 對包含和不包含刺激物的染料和緩沖液/培養(yǎng)基的無細(xì)胞混合物進(jìn)行熒光檢測。在不含細(xì)胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，隨著時間熒光的逐漸增加可能與瞬間水解、空氣氧化、和/或光誘導(dǎo)氧化有關(guān)。

6.4 檢查培養(yǎng)在生長培養(yǎng)液或簡單緩沖液內(nèi)的未處理加載細(xì)胞（對照）的熒光。在健康細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)酶和/或天然抗氧化劑會清除這些氧自由基。經(jīng)過染料加載復(fù)原時間后，健康細(xì)胞應(yīng)該表現(xiàn)出低水平的熒光信號，且在整個實驗期間相對穩(wěn)定。然而，逐漸增加（由于自氧化）或降低（由于細(xì)胞內(nèi)染料喪失或光淬滅）也有可能觀察到。在不含任何刺激物或誘導(dǎo)劑的體系內(nèi)，健康和未處理細(xì)胞突然發(fā)現(xiàn)強(qiáng)熒光，表明細(xì)胞發(fā)生死亡或一些其他的氧化事件。

7）建立陽性對照（Positive control），可能用以下方法刺激氧化活性：

7.1 腫瘤促進(jìn)劑（PMA，工作濃度100pM~10μM）

7.2 H2O2或TBHP（終濃度~100μM）（根據(jù)細(xì)胞本身對其的靈敏度和反應(yīng)性來提高或降低濃度）

8）確保刺激藥物或化合物不會引起染料熒光淬滅。檢查化合物的吸收光譜，確定化合物的吸收峰不會與氧化后染料的最大激發(fā)或發(fā)射光譜發(fā)生重疊。

附表1 活性氧探針（HPF, APF, DCFH）對各種活性氧物質(zhì)的反應(yīng)特異性

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