Hoechst 33342/PI Double Stain Kit 凋亡/壞死雙染試劑盒

溫馨提示：見我司整理的細胞核（Cell Nuclear）熒光探針產(chǎn)品專題。

產(chǎn)品描述

Hoechst 33342/PI細胞凋亡雙染試劑盒（Hoechst 33342/PI Double Stain Kit）是一種采用Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）雙染進行細胞凋亡與壞死分析的檢測試劑盒。檢測原理在于：Hoechst 33342是一種活細胞核染料，能穿透正常細胞以及凋亡細胞膜，與DNA結合（最大激發(fā)波長為350nm，發(fā)射波長為461nm），呈現(xiàn)藍色熒光。當細胞發(fā)生凋亡，染色質發(fā)生固縮，染色后的細胞熒光比正常細胞明顯增強。而PI是一種死細胞核染料，不能穿透細胞膜，對于具完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色。但對于壞死細胞，由于膜的完整性喪失，PI能夠穿透進入細胞，與DNA結合（最大激發(fā)波長為536nm，發(fā)射波長為617nm），呈現(xiàn)紅色熒光。經(jīng)Hoechst 33342/PI雙染后，使用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測，正常細胞為弱紅色熒光+弱藍色熒光；凋亡細胞為弱紅色熒光+強藍色熒光；壞死細胞為強紅色熒光+弱藍色熒光。

本試劑盒可檢測100個樣品，每個樣本的細胞數(shù)量可為10⁵-10⁶個。

產(chǎn)品包裝

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年有效。使用頻繁可置4℃保存，5個月有效。Hoechst染色液和PI染色液需避光保存。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）熒光染料均存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。

2）Hoechst 33342孵育細胞時間不宜過長，一般控制在20min內(nèi)。太長容易引起探針的發(fā)射光譜由藍光向紅光遷移，導致紅色熒光與藍色熒光的比例改變。

3）PI對人體有一定的刺激性，請注意適當防護。

4）如果要進行組織的凋亡和壞死檢測，請將組織消化制備成單細胞懸液后再檢測。

5）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法：

一、細胞樣本制備

1.1貼壁細胞

1.1.1 小心收集細胞培養(yǎng)液到一個無菌離心管內(nèi)備用；

1.1.2 用胰蛋白酶消化細胞至細胞可以輕輕用移液槍或槍頭吹打下來，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有貼壁細胞，并輕輕吹散細胞

1.1.3 收集上述細胞懸液到離心管內(nèi)，4℃，1000g離心3~5min，使細胞沉至管底，小心吸取上清并丟棄，可留約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細胞。【注意】：某些特殊細胞，如果沉淀不充分，可以適當提高離心力或者延長離心時間。

1.1.4 加入約1ml提前預冷的PBS，重懸細胞，并轉移到1.5ml無菌離心管，4℃，1000g離心3~5min，使細胞沉至管底。

1.1.5 小心吸取上清并丟棄，可留約50μl PBS，以免吸走細胞。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。

1.2 懸浮細胞

1.2.1 4℃，1000g離心3~5min，使細胞沉至管底，小心吸取上清并丟棄，可留約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細胞。

1.2.2 加入約1ml提前預冷的PBS，重懸細胞，并轉移到1.5ml無菌離心管，4℃，1000g離心3~5min，使細胞沉至管底。

1.2.3 小心吸取上清并丟棄，可留約50μl PBS，以免吸走細胞。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。

二、染色前制備

2.1細胞染色緩沖液（1×）的準備：取適量細胞染色緩沖液（2×）與無菌去離子水或蒸餾水等比例混合，即為細胞染色緩沖液（1×），4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2.2 細胞重懸：將上述收集好的0.1~1×06細胞，加入0.9ml細胞染色緩沖液（1×），重懸細胞沉淀。

三、Hoechst 33342/PI雙染

3.1加入5μl Hoechst 33342染色液，置于37℃水浴，孵育5~15min。

3.2置于冰水冷卻，4℃，1000g離心3~5min，使細胞沉至管底，棄上層染色液。

3.3加入0.9ml細胞染色緩沖液（1×），重懸細胞沉淀。

3.4加入5μl PI染色液，置于冰浴或4℃，孵育20~30min。

【注意】：也可一步法進行染色：加入5μl Hoechst 33342染色液和5μl PI染色液，輕輕混勻，置于冰浴或4℃，孵育20~30min。

四、結果分析

4.1流式細胞儀檢測

用流式細胞儀在激發(fā)波長400~500nm處檢測藍色熒光，在＞630nm處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。

4.2熒光顯微鏡檢測

檢測前，4℃，1000g離心3～5min沉淀細胞，用PBS洗滌一次，再涂片觀察紅色和藍色熒光。

【注意】：對于貼壁細胞，也可不收集細胞，棄培養(yǎng)液后直接依次按照上述比例加入細胞染色緩沖液（1×）、Hoechst 33342染色液、PI染色液，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。染色后，PBS洗滌一次，再在熒光顯微鏡下觀察。

4.3 結果呈現(xiàn)

正常細胞呈低藍光/低紅光，凋亡細胞呈高藍光/低紅光；壞死細胞呈低藍光/高紅光。

注意事項：

1）Hoechst 33342、PI對人體有害，請注意適當防護；

2）Hoechst 33342、PI需避光，整個實驗過程盡量避光操作；

3）熒光染料均存在淬滅情況，建議染色后需盡快檢測；

4）Hoechst 33342 與細胞孵育時間不宜過長，一般控制在20 min以內(nèi)。太長容易引起該染料的發(fā)射光譜由藍光向紅光遷移，導致紅色熒光和藍色熒光比例改變。

5）如果用于組織樣品檢測，則必須把組織消化制備成單細胞懸浮液后才可以進行檢測。

6）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。