Alamar Blue 阿爾瑪藍細胞增殖及毒性檢測試劑

產(chǎn)品簡介：

阿爾瑪藍（Alamar Blue）是一種細胞活力檢測試劑，包含一種具細胞膜滲透性、無毒性且弱藍色熒光的指示劑，即刃天青（resazurin）。自從1993年開始刃天青就作為一種值得信賴和可靠的試劑被引用。阿爾瑪藍是MTT（噻唑蘭）的有效且無毒替代物。阿爾瑪藍能定量檢測人、哺乳動物、細菌、真菌和支原體細胞的增殖情況，也能用于細胞因子生物活性、細胞活力分析、體外細胞毒性確定以及細胞生長監(jiān)測。

阿爾瑪藍的工作原理在于：刃天青是一種氧化還原（REDOX）指示劑，根據(jù)細胞代謝還原情況發(fā)生顏色變化。氧化態(tài)的刃天青呈紫藍色且基本無熒光，其還原態(tài)產(chǎn)物試鹵靈（resorufin）轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色且高度熒光，產(chǎn)生的熒光強度與呼吸活細胞數(shù)量呈正比。通過檢測呼吸過程中氧化水平，阿爾瑪藍用作一種定量檢測細胞活力和毒性的直接指示劑。阿爾瑪藍的顏色變化可通過普通分光光度計檢測吸光度變化，檢測波長為570nm，參考波長為600nm；阿爾瑪藍的熒光變化可通過熒光光度計檢測，激發(fā)波長在530~560nm之間，發(fā)射波長為590nm。

與臺盼藍、TTC、MTT、MTS等分析法相比，阿爾瑪藍為單一試劑，可連續(xù)快速的檢測細胞的增殖情況。阿爾瑪藍對細胞無毒無害，不會干擾電子傳遞鏈，不會干擾細胞呼吸或功能，也不會影響細胞的抗體合成與分泌等活性，因此適用于對同一批細胞的增殖情況進行連續(xù)觀察和更進一步的觀察，具有操作簡便和幾乎不干擾正常代謝的特征。

保存條件: 

4℃避光保存，至少一年有效。

產(chǎn)品使用：

一、標準曲線制作（最佳孵育時間和細胞密度的測定）

1. 收集對數(shù)生長期的細胞并進行細胞計數(shù)。每孔接種100μl細胞懸液，按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成濃度梯度，一般做3-5個濃度梯度，每個濃度做3-6個復孔。注意要設(shè)置陰性對照（細胞培養(yǎng)基中不加入細胞）和陽性對照（只加100μl 100%還原態(tài)Alamar Blue，不含細胞）。

2. 每孔加入10μlAlamar Blue，陽性對照孔加入10μl無菌超純水。

3. 將平板放回細胞培養(yǎng)箱孵育。接下來的6-8h內(nèi)每隔1h取出平板并測定熒光/吸光值。建議平板孵育過夜并測定第24h的熒光/吸光值，得到以下兩組數(shù)據(jù)：

a）在任何選定的孵育時間內(nèi)，與細胞數(shù)量相關(guān)的細胞密度對Alamar Blue還原水平通過線性反應來確定；

b）在任何選定的細胞密度上，測定隨著對照細胞所需時間將Alamar Blue從氧化態(tài)（藍色）轉(zhuǎn)化為完全還原態(tài)（紅色）來確定所需的孵育時間；

4.推薦用熒光分光光度計檢測，激發(fā)光波長在530-560 nm之間，發(fā)射光波長為590 nm?；蛘哂闷胀ǚ止夤舛扔嬙?span>570nm測定吸光值，參考波長600nm。也可用570/630nm和540/600nm替代。

5.計算在每個特定細胞密度或孵育時間上Alamar Blue的還原率。

a）公式 1：通過吸光值來計算還原率

Alamar Blue還原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-（E600′×C570）] ×100

E600=氧化態(tài)Alamar Blue在600nm波長的消光系數(shù)；

E570=氧化型Alamar Blue在570nm波長的消光系數(shù)；

A600=檢測孔在600nm波長的吸光值；

A570=檢測孔在570nm波長的吸光值；

E570′=還原態(tài)Alamar Blue在570nm波長的消光系數(shù)；

E600′=還原態(tài)Alamar Blue在600nm波長的消光系數(shù)；

C570=陰性對照孔在570nm波長的吸光值（不加細胞的培養(yǎng)基+Alamar Blue）；

C600=陰性對照孔在600nm波長的吸光值（不加細胞的培養(yǎng)基+Alamar Blue）；

 表 1. 阿爾瑪藍（Alamar Blue）在不同波長下的消光系數(shù)

b）公式 2：通過熒光值來計算還原率

Alamar Blue 還原率（％）=（實驗組 FI 590-陰性對照組 FI 590）/（100%還原態(tài) Alamar Blue 陽性對照 FI 590-陰性對照組 FI 590）×100

FI 590=590nm 發(fā)射波長（560nm 激發(fā)波長）下的熒光強度；

6. 繪制在每個特定細胞密度或孵育時間 Alamar Blue 的還原率:

a）對確定最佳細胞密度的實驗，以細胞密度的對數(shù)（log）為 x 坐標，Alamar Blue 還原率為縱坐標；

b）對確定最佳孵育時間的實驗，以孵育時間為 x 坐標，Alamar Blue 還原率為縱坐標；

c）根據(jù)以上曲線圖來確定最佳細胞密度或孵育時間。

二、細胞毒性和細胞增殖檢測

1. 收集對數(shù)生長期的細胞并進行細胞計數(shù)。調(diào)整細胞數(shù)為 1×10⁴ 個/ml（建議細胞密度），每孔接種 100μl細胞懸液。最佳細胞密度需根據(jù)細胞類型決定。

2. 細胞鋪板，并加入待檢測藥物。為了確定藥物對細胞生長影響，需設(shè)置合適的對照組，包括刺激和無刺

激細胞組。

3. 振蕩混勻，放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一段時間。

4. 無菌條件下每孔加入 10μl Alamar Blue。陽性對照孔中加入 10μl 無菌的超純水。

5. 放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 4-8h，最佳孵育時間取決于細胞類型。

6. 使用光度計測定細胞毒性或增殖情況。

7. 推薦用熒光分光光度計檢測，激發(fā)光波長在 530-560 nm 之間，發(fā)射光波長為 590 nm?；蛘哂闷胀ǚ止夤舛扔嬙?span> 570nm 測定吸光值，參考波長 600nm。使用培養(yǎng)基為空白對照。

8. 計算細胞毒性和增殖實驗下對照細胞和處理細胞間 Alamar Blue 還原度的變化百分比。

a）公式 3：通過吸光值來計算還原度的變化百分比:

Alamar Blue還原度變化百分比（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[( E600×P570)-（E570×P600）] ×100

E600=氧化態(tài) Alamar Blue 在 600nm 波長的消光系數(shù)；

E570=氧化態(tài) Alamar Blue 在 570nm 波長的消光系數(shù)；

A600=檢測孔在 600nm 波長的吸光值；

A570=檢測孔在 570nm 波長的吸光值；

P570=陽性對照孔在 570nm 波長的吸光值（不含待測藥物的細胞+ Alamar Blue）;

P600=陽性對照孔在 600nm 波長的吸光值（不含待測藥物的細胞+ Alamar Blue）;

結(jié)果判斷：假如 Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=62%，說明相對于對照孔，檢測孔 Alamar Blue 的還原變化值為 62%，換句話而言，相對于對照孔，38%的檢測孔細胞生長受到抑制。

表 1. 阿爾瑪藍（Alamar Blue）在不同波長下的消光系數(shù)

b）公式 4：通過熒光值來計算還原度的變化百分比

Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=（實驗組 FI 590/陰性對照組 FI 590）×100

FI 590=590nm 發(fā)射波長（560nm 激發(fā)波長）下的熒光強度；

結(jié)果判斷：假如 Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=25%，說明相對于對照孔，檢測孔 Alamar Blue 的還原變化值為 25%，換句話而言，相對于對照孔，75%的檢測孔細胞生長受到抑制。

注意事項：

1.      還原態(tài)的Alamar Blue在水或水溶性緩沖液如PBS中很不穩(wěn)定，但在培養(yǎng)基內(nèi)非常穩(wěn)定。為了確定特定實驗還原態(tài)Alamar Blue的吸光度/熒光值，需準備100%還原態(tài)Alamar Blue試劑：將Alamar Blue與細胞培養(yǎng)基按照1:10的比例混合，高壓滅菌15min即可。

2.      適宜的細胞密度能夠增加檢測靈敏度。對于96孔板，建議每孔接種100μl細胞，細胞濃度范圍：貼壁細胞為100-10,000個/孔，懸浮細胞在2,000-50,000個/孔，以培養(yǎng)基為空白對照。對于384孔板，細胞濃度和接種量均減半。

3.      影響細胞對Alamar Blue反應的兩大變量為孵育時間和鋪板密度，建議實驗前需先摸索優(yōu)化這兩個因素。細胞密度過高或孵育時間過長都會導致繼發(fā)性還原反應，紅色產(chǎn)物停止增加并開始衰減，導致吸光度/熒光水平明顯下跌并伴隨紅色消失。

4.      微生物污染會還原Alamar Blue。因此對被污染細胞使用Alamar Blue檢測會引起錯誤結(jié)果。

5.      Alamar Blue可以用分光光度計或熒光計檢測，但熒光靈敏度高，實驗誤差小，推薦熒光檢測。

6.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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