FerroOrange (Fe2+indicator)   亞鐵離子熒光探針

產(chǎn)品簡介：

FerroOrange是一種特異性檢測不穩(wěn)定的鐵(II)離子（Fe²⁺）的熒光探針，定位在內(nèi)質網(wǎng)（ER）。一旦與Fe²⁺反應后，不可逆的生成一種橙色熒光產(chǎn)物（Absmax=542nm，FLmax

=572nm，圖1. FerroOrange的光譜特征）。鐵（III）離子（Fe³⁺）或其它除鐵離子以外的二價金屬離子都不會使其熒光增強（見圖2. FerroOrange的反應特異性）。FerroOrange也不會與鐵蛋白和其它物質中的螯合鐵反應。FerroOrange具強細胞膜滲透性和低細胞毒性（見附圖3. FerroOrange的細胞毒性測定），非常適用于活細胞成像。

圖1. FerroOrange的光譜特征。FerroOrange在0.05M HEPES buffer, pH 7.4內(nèi)的吸收光譜（左）和熒光光譜。最大吸收波長在542nm，最大熒光光譜在572nm。一旦與Fe²⁺反應，熒光強度顯著增加。

圖2. FerroOrange的反應特異性。FerroOrange與各種金屬離子（左），活性氧或還原劑（右）的反應性。僅當與Fe²⁺反應，FerroOrange呈強熒光。

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

產(chǎn)品使用：

1. 需要自行準備的材料

1.1 細胞培養(yǎng)級DMSO

1.2 合適的清洗和觀察緩沖液（比如：PBS, pH 7.4；HBSS；無血清培養(yǎng)基等）。不要含酚紅。

2. 探針準備

2.1 從冰箱取出FerroOrange，置于室溫至少30min，將其置于微量離心機內(nèi)低速離心。將瓶內(nèi)的粉末離心到管底后，再開蓋。

2.2 往一管FerroOrange（24μg）內(nèi)加入35μl高質量DMSO，用槍反復吹吸5次或以上，使其完全溶解即得到1mM FerroOrange儲存液。若單次不能用完儲存液，請根據(jù)單次用量分裝，置于-20℃避光保存，一個月內(nèi)使用。

2.3 于正式實驗前，用中性緩沖液或細胞培養(yǎng)基來稀釋1mM FerroOrange儲存液到所需工作濃度（比如：1μM），工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，盡快用完?！咀⒁猓核嵝匀芤簳趸?span>FerroOrange，嚴重影響探針的效率】。

3. 染色步驟

3.1  從玻璃底培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的細胞中吸掉培養(yǎng)液。
3.2  吸掉上清液，用 HBSS 清洗細胞 2 次。
3.3  加入含 1μM  FerroOrange 的染色工作液，于 37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育 60min。
3.4  在熒光顯微鏡下觀察細胞。

4. 熒光檢測

對于熒光顯微鏡：通用的G激發(fā)濾片比如Cy3檢測用的濾片。

對于激光顯微鏡和流式細胞儀：532nm，514nm或561nm激光器用于激發(fā)。實在沒有，亦可用488nm激光器。發(fā)射波長為572nm。

附錄 FerroOrange的細胞毒性：

圖3. 各種濃度FerroOrange對HepG2細胞的代謝活性。不同濃度的FerroOrange（以1% DMSO作為共溶劑）加入細胞內(nèi)，培養(yǎng)24h后，用MTT法測定代謝活性。（n=3）

附錄FerroOrange的胞內(nèi)定位：

圖4. FerroOrange的胞內(nèi)定位。將FerroOrange（紅色）, ER Tracker（綠色）和Hoechist 3342（藍色）加載進入HT-1080細胞并成像觀察。FerroOrange主要定位在內(nèi)質網(wǎng)。Bar：10 μm。

注意事項：

1.      FerroOrange主要定位在內(nèi)質網(wǎng)（見附圖4），但也可能檢測細胞質池內(nèi)的Fe²⁺，目前針對這一點未做明確評估。

2.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

3.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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