DAF-FM DA 一氧化氮（NO）熒光探針（固體粉末）

產(chǎn)品簡介：

DAF-FM DA，也稱為DAF-FM Diacetate，或4-Amino-5-Methylamino-2',7'

-Difluorofluorescein Diacetate，是新一代用于檢測和定量一氧化氮（Nitric oxide，NO）的熒光探針。具有細胞膜滲透性，無熒光。一旦進入細胞后，被細胞內(nèi)的酯酶催化形成不具有膜滲透性的DAF-FM。DAF-FM本身僅有弱熒光，但和NO反應(yīng)后可產(chǎn)生強烈熒光，最大激發(fā)波長為495nm，最大發(fā)射波長為515nm。任何可以檢測熒光素的儀器都能檢測，包括流式細胞儀、熒光顯微鏡、熒光酶標板和熒光計。

    與傳統(tǒng)的NO熒光探針—DAF-2 DA相比，DAF-FM DA具有以下重要優(yōu)勢：a）DAF-FM-NO加合物的光譜特性在pH 5.5以上不受pH影響；b）DAF-FM-NO加合物具有更顯著的光穩(wěn)定性，意味其提供更多的時間來捕捉圖像；c）DAF-FM對NO的檢測靈敏度更高，前者的檢測下限~3nM；而DAF-2的檢測下限~5nM。

本品以固體粉末形式提供，需用無水的DMSO溶解，用合適的生理緩沖液或新鮮培養(yǎng)基（不含血清和酚紅）稀釋到相應(yīng)的工作濃度即可，建議起始工作濃度范圍是1-10μM。

產(chǎn)品特性：

1） CAS NO.：254109-22-3

2） 化學(xué)名：3',6'-bis(acetyloxy)-4-amino-2',7'-difluoro-5-(methylamino)-spiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H] xanthen]-3-one

3） 英文同義名：DAF-FM Diacetate; 4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate; 3-Amino, 4- aminomethyl-2?,7?-difluorofluorescein Diacetate; Diaminofluorescein-FM diacetate;

4） 中文同義名：DAF-FM二乙酸鹽；二氨基熒光素-FM二乙酸鹽；4-氨基-5-甲氨基-2',7'-二氟熒光素二乙酸鹽；3-氨基, 4-氨甲基-2?,7?-二氟熒光素二乙酸鹽；

5） 分子式：C25H18F2N2O7

6） 分子量：496.42

7） 純度：≥98%（HPLC）

8） 外觀：無色至淡黃色溶液

9） Ex/Em：~495/515 nm (DAF-FM)

10）化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，1年有效。

產(chǎn)品使用：

一、 工作液制備

取用50ug DAF-FM DA加入新鮮無水的DMSO 20.1442 μL溶解至濃度為5mM， 用合適的生理緩沖液或新鮮培養(yǎng)基（不含血清和酚紅）稀釋到相應(yīng)的工作濃度即可，探針的推薦使用濃度為1-10μM，初次使用需根據(jù)自身實驗體系來進行加載濃度。比如取5μl DAF-FM DA(5mM)按照1：1000的比例稀釋到5ml DAF-FM DA(5μM)工作液，充分混勻。

【注意】工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，實驗結(jié)束后需丟棄多余探針。由于染料在水溶液中更容易氧化分解，為此，請盡快用完。

【注意】探針的最佳工作濃度需根據(jù)自身的細胞類型或?qū)嶒灄l件來摸索，或參考文獻。一般情況下，在保證獲得足量熒光信號的前提下，盡量選擇最小濃度的探針，這樣可盡量減少酯的水解副產(chǎn)物如甲醛和乙酸的富集。

二、 探針裝載

對于刺激時間較短（通常為2h以內(nèi)）的細胞，先裝載探針，后用適當?shù)年栃詫φ占白约焊信d趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長（通常為6h以上）的細胞，先用適當?shù)年栃詫φ占白约焊信d趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。

2.1 探針原位裝載（僅適用于貼壁細胞）

a）去除細胞培養(yǎng)液，加入適當體積準備好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀釋后的工作液）。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入工作液體積為1ml。

b）37℃孵育20min。

c）用PBS, pH7.4洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DAF-FM DA。

2.2 收集細胞后探針裝載

a）細胞收集后，用適當體積準備好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀釋后的工作液）重懸細胞，使得細胞濃度為一百萬至二千萬/毫升。

b）37℃孵育20min。以上操作可以在離心管內(nèi)進行。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。c）用PBS, pH7.4洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DAF-FM DA。

d）直接用適當?shù)年栃詫φ栈蜃约焊信d趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后再刺激細胞。

三、 熒光檢測

3.1對于原位裝載探針的樣品：可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察（用普通的熒光顯微鏡觀察效果相對較差），或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

3.2 對于收集細胞后裝載探針的樣品：可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。

3.3 參數(shù)設(shè)置：使用495nm激發(fā)波長，515nm發(fā)射波長，實時、逐時間點或單時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DAF-FM-NO反應(yīng)產(chǎn)物的熒光光譜和熒光素（Fluorescein）非常相似，可以用檢測熒光素的參數(shù)設(shè)置進行檢測，用檢測FITC的參數(shù)設(shè)置進行檢測也可以。

四、 其他說明

4.1 上述步驟推薦DAF-FM DA的工作濃度為5μM。對于某些細胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2000-1:5000的比例稀釋DAF-FM DA，使裝載探針時DAF-FM DA的工作濃度為1-2.5μM。相反，如果發(fā)現(xiàn)用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可以把DAF-FM DA的工作濃度為調(diào)整為10μM，以提高檢測的靈敏度。

4.2 探針裝載的時間可以根據(jù)情況在15-60min內(nèi)適當進行調(diào)整。

注意事項：

1.      DAF-FM DA在4℃、冰浴等較低溫度下會凝固而粘附在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在25℃溫育片刻直至完全溶解后再使用。

2.      第一次使用本品，請置于室溫或25℃溫育片刻直至完全溶解后，低速離心后，根據(jù)單次用量分成小包裝后-20℃避光干燥保存，避免反復(fù)凍融。

3.      BSA和酚紅對DAF-FM的熒光檢測有干擾，請避免體系內(nèi)含有這些組分。

4.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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