DAF-FM DA (5mM in DMSO)一氧化氮（NO）熒光探針

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

DAF-FM DA，也稱為DAF-FM Diacetate，或4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate，是新一代用于檢測(cè)和定量一氧化氮（Nitric oxide，NO）的熒光探針。具有細(xì)胞膜滲透性，無熒光。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶催化形成不具有膜滲透性的DAF-FM。DAF-FM本身僅有弱熒光，但和NO反應(yīng)后可產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，最大激發(fā)波長(zhǎng)為495nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為515nm。任何可以檢測(cè)熒光素的儀器都能檢測(cè)，包括流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡、熒光酶標(biāo)板和熒光計(jì)。

與傳統(tǒng)的NO熒光探針—DAF-2 DA相比，DAF-FM DA具有以下重要優(yōu)勢(shì)：a）DAF-FM-NO加合物的光譜特性在pH 5.5以上不受pH影響；b）DAF-FM-NO加合物具有更顯著的光穩(wěn)定性，意味其提供更多的時(shí)間來捕捉圖像；c）DAF-FM對(duì)NO的檢測(cè)靈敏度更高，前者的檢測(cè)下限~3nM；而DAF-2的檢測(cè)下限~5nM。

本品以溶于DMSO的儲(chǔ)存液形式提供，濃度為5mM。使用簡(jiǎn)單，只需用合適的生理緩沖液或培養(yǎng)基稀釋到相應(yīng)的工作濃度即可。建議起始工作濃度范圍是1-10μM。

本品適合細(xì)胞內(nèi)NO的檢測(cè)，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。若收集細(xì)胞后再裝載探針，通常至少能檢測(cè)100個(gè)樣品。

產(chǎn)品特性

1） CAS NO.：254109-22-3

2） 化學(xué)名：3',6'-bis(acetyloxy)-4-amino-2',7'-difluoro-5-(methylamino)-spiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H] xanthen]-3-one

3） 英文同義名：DAF-FM Diacetate; 4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate; 3-Amino, 4- aminomethyl-2?,7?-difluorofluorescein Diacetate; Diaminofluorescein-FM diacetate;

4） 中文同義名：DAF-FM二乙酸鹽；二氨基熒光素-FM二乙酸鹽；4-氨基-5-甲氨基-2',7'-二氟熒光素二乙酸鹽；3-氨基, 4-氨甲基-2?,7?-二氟熒光素二乙酸鹽；

5） 分子式：C25H18F2N2O7

6） 分子量：496.42

7） 純度：≥98%（HPLC）

8） 外觀：無色至淡黃色溶液

9） Ex/Em：~495/515 nm (DAF-FM)

10）化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，1年有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

一、 工作液制備

取適量的母液用本試劑盒提供的稀釋緩沖液或自行準(zhǔn)備的新鮮培養(yǎng)基（不含血清和酚紅）稀釋到工作濃度，比如取5μl DAF-FM DA(5mM)按照1：1000的比例稀釋到5ml DAF-FM DA(5μM)工作液，充分混勻。

【注意】工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需丟棄多余探針。由于染料在水溶液中更容易氧化分解，為此，請(qǐng)盡快用完。

【注意】探針的最佳工作濃度需根據(jù)自身的細(xì)胞類型或?qū)嶒?yàn)條件來摸索，或參考文獻(xiàn)。一般情況下，在保證獲得足量熒光信號(hào)的前提下，盡量選擇最小濃度的探針，這樣可盡量減少酯的水解副產(chǎn)物如甲醛和乙酸的富集。

二、 探針裝載

對(duì)于刺激時(shí)間較短（通常為2h以內(nèi)）的細(xì)胞，先裝載探針，后用適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照及自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(zhǎng)（通常為6h以上）的細(xì)胞，先用適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照及自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

2.1 探針原位裝載（僅適用于貼壁細(xì)胞）

a）去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積準(zhǔn)備好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀釋后的工作液）。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入工作液體積為1ml。

b）37℃孵育20min。

c）用PBS, pH7.4洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA。

2.2 收集細(xì)胞后探針裝載

a）細(xì)胞收集后，用適當(dāng)體積準(zhǔn)備好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀釋后的工作液）重懸細(xì)胞，使得細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/毫升。

b）37℃孵育20min。以上操作可以在離心管內(nèi)進(jìn)行。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。c）用PBS, pH7.4洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA。

d）直接用適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后再刺激細(xì)胞。

三、 熒光檢測(cè)

3.1對(duì)于原位裝載探針的樣品：可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察（用普通的熒光顯微鏡觀察效果相對(duì)較差），或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.2 對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品：可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。

3.3 參數(shù)設(shè)置：使用495nm激發(fā)波長(zhǎng)，515nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)、逐時(shí)間點(diǎn)或單時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DAF-FM-NO反應(yīng)產(chǎn)物的熒光光譜和熒光素（Fluorescein）非常相似，可以用檢測(cè)熒光素的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)，用檢測(cè)FITC的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)也可以。

四、 其他說明

4.1 上述步驟推薦DAF-FM DA的工作濃度為5μM。對(duì)于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1:2000-1:5000的比例稀釋DAF-FM DA，使裝載探針時(shí)DAF-FM DA的工作濃度為1-2.5μM。相反，如果發(fā)現(xiàn)用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可以把DAF-FM DA的工作濃度為調(diào)整為10μM，以提高檢測(cè)的靈敏度。

4.2 探針裝載的時(shí)間可以根據(jù)情況在15-60min內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

注意事項(xiàng)：

1.      DAF-FM DA在4℃、冰浴等較低溫度下會(huì)凝固而粘附在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在25℃溫育片刻直至完全溶解后再使用。

2.      第一次使用本品，請(qǐng)置于室溫或25℃溫育片刻直至完全溶解后，低速離心后，根據(jù)單次用量分成小包裝后-20℃避光干燥保存，避免反復(fù)凍融。

3.      BSA和酚紅對(duì)DAF-FM的熒光檢測(cè)有干擾，請(qǐng)避免體系內(nèi)含有這些組分。

4.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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