5-TAMRA標(biāo)記鬼筆環(huán)肽

5-TAMRA Phalloidin

產(chǎn)品簡介：

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin），又稱鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）中分離到的一種七肽毒素，以極高的親和力和特異性結(jié)合肌動蛋白絲F-actin（聚合形式的肌動蛋白），不會結(jié)合單體肌動蛋白（G-actin）。不像肌動蛋白抗體，同時識別單體和聚合形式的肌動蛋白。鬼筆環(huán)肽對大小纖維的親和力相近，在許多不同的動植物物種的肌肉和非肌肉細(xì)胞中，基本都按照一個肌動蛋白亞基與一個鬼筆環(huán)肽分子的化學(xué)計量比結(jié)合。不像肌動蛋白抗體，對不同物種或來源的肌動蛋白親和力會發(fā)生明顯變化。鬼筆環(huán)肽的非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色和未染色區(qū)域的差異極其明顯。鬼筆環(huán)肽使得肌動蛋白聚合/解離的臨界濃度降至1μg/ml，可用作一種聚合增強(qiáng)劑。另外，產(chǎn)生的復(fù)合物高度穩(wěn)定（解離常數(shù)約3×10–8M），能夠抑制細(xì)胞松弛素、碘化鉀和溫度上升引起的去聚合和去組裝活性。

鬼筆環(huán)肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對F-actin染色，且水溶性良好，是非常實(shí)用和方便的探針，對組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞體系內(nèi)的F-actin進(jìn)行定性和定量研究。另外，鬼筆環(huán)肽及其衍生物很小，直徑約12–15 ?，分子量<2000 Da，經(jīng)標(biāo)記后的F-actin仍維持許多標(biāo)記前的功能。比如，標(biāo)記的甘油抽提肌纖維仍能收縮；標(biāo)記的肌動蛋白絲仍能在固相肌球蛋白基質(zhì)中移動。

本品為5-TAMRA熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（5-TAMRA-Phalloidin），凍干粉形式提供，可直接溶于甲醇或DMSO配置成適當(dāng)濃度的儲存液。之后用PBS或PBS+1% BSA稀釋到合適的工作濃度。常用工作濃度范圍80-200nM。

產(chǎn)品應(yīng)用

1） 對固定的組織切片和組織細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行肌動蛋白絲（F-actin）的熒光染色；

2） 體外制備穩(wěn)定的熒光肌動蛋白絲（F-actin）；

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，2年有效。

產(chǎn)品使用：

操作流程（免疫熒光染色）

有幾種方法都能用來染色組織細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)的肌動蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細(xì)胞F-actin分布情況中至關(guān)重要。固定步驟基于實(shí)驗(yàn)自身需求來選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

1.1 5-TAMRA Phalloidin（Cat# NBS5817）

1.2 1 x PBS緩沖液（細(xì)胞培養(yǎng)級別）（Cat# NBS3021）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）（Cat# NBS0135）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑（Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032或DAPI Fluoromount-G 抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0033）

1.6 即用型DAPI染液（Cat# NBS1206）

1.8 （可選）牛血清白蛋白 (第五組分)（Bovine Serum Albumin，BSA）（Cat# NBS0218）

1.9 蓋玻片密封液（透明指甲油）

二、染色工作液準(zhǔn)備

2.1 取低溫保存的5-TAMRA-Phalloidin凍干粉置于室溫回溫至少20min，低速離心后，加入甲醇或無水DMSO充分溶解配制成20-100μM儲存液。根據(jù)單次用量進(jìn)行分裝，置于-20℃避光保存，一年穩(wěn)定?！咀⒁狻浚?span>5-TAMRA- Phalloidin的分子量（Mw）以標(biāo)簽為準(zhǔn)。

2.2 正式實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）稀釋儲存液到需要的工作濃度，常用的工作濃度范圍為80-200nM?？梢?span>100nM為起始工作濃度，最佳的工作濃度請參考文獻(xiàn)或根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有體系來摸索。

【注①】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環(huán)肽粘附到管壁的可能性。

【注②】：染色工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫避光保存。

三、染色流程

3.1 細(xì)胞爬片培養(yǎng)，使其密度至少達(dá)半?yún)R合。

3.2 吸掉培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。

3.3 用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫固定10min?！咀⒁狻浚汗潭ㄟ^程中甲醇能破壞肌動蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。最好的固定液是無甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5 用破膜緩沖液透化細(xì)胞，室溫處理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取200μl現(xiàn)配的5-TAMRA-Phallodin染色工作液，完全覆蓋蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育30min?！咀⒁狻浚和ǔＧ闆r4℃-37℃都適合用于染色。為了避免工作液的揮發(fā)，孵育過程將蓋玻片置于一密封的容器內(nèi)。

3.8 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9 取200μl DAPI溶液（100nM）或商業(yè)化的即用型DAPI染色液對細(xì)胞核復(fù)染，室溫約30s。

3.10 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞1-2次，室溫下30s/次。

3.11 將蓋玻片倒置在滴有一滴抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032）的載玻片上。用紙巾輕輕吸掉多余淬滅劑，然后用透明指甲油密封蓋玻片四周。將此法處理玻片置于4℃避光存放至少6個月仍能維持F-actin染色。

【可選】：完成步驟3.8后，直接將蓋玻片倒置在含DAPI的抗熒光淬滅劑（如DAPI Fluoromount-G 抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0033）的載玻片上。然后吸掉多余淬滅劑并用指甲油密封蓋玻片四周。

3.12 熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，選擇5-TAMRA激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=546/575nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事項：

1.      本品具有一定的毒性，LD50=2mg/kg，操作時請注意防護(hù)。

2.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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