TRITC Phalloidin TRITC標記鬼筆環(huán)肽

【溫馨提示】：見我司整理的鬼筆環(huán)肽及偶聯(lián)物（Phalloidin and Phalloidin Conjugates）產(chǎn)品專題。

產(chǎn)品簡介：

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin），又稱鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）中分離到的一種七肽毒素，以極高的親和力和特異性結(jié)合肌動蛋白絲F-actin（聚合形式的肌動蛋白），不會結(jié)合單體肌動蛋白（G-actin）。不像肌動蛋白抗體，同時識別單體和聚合形式的肌動蛋白。鬼筆環(huán)肽對大小纖維的親和力相近，在許多不同的動植物物種的肌肉和非肌肉細胞中，基本都按照一個肌動蛋白亞基與一個鬼筆環(huán)肽分子的化學(xué)計量比結(jié)合。不像肌動蛋白抗體，對不同物種或來源的肌動蛋白親和力會發(fā)生明顯變化。鬼筆環(huán)肽的非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色和未染色區(qū)域的差異極其明顯。鬼筆環(huán)肽使得肌動蛋白聚合/解離的臨界濃度降至1μg/ml，可用作一種聚合增強劑。另外，產(chǎn)生的復(fù)合物高度穩(wěn)定（解離常數(shù)約3×10–8M），能夠抑制細胞松弛素、碘化鉀和溫度上升引起的去聚合和去組裝活性。

鬼筆環(huán)肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對F-actin染色，且水溶性良好，是非常實用和方便的探針，對組織切片、細胞培養(yǎng)物或無細胞體系內(nèi)的F-actin進行定性和定量研究。另外，鬼筆環(huán)肽及其衍生物很小，直徑約12–15 ?，分子量<2000 Da，經(jīng)標記后的F-actin仍維持許多標記前的功能。比如，標記的甘油抽提肌纖維仍能收縮；標記的肌動蛋白絲仍能在固相肌球蛋白基質(zhì)中移動。

本品為TRITC熒光標記的鬼筆環(huán)肽（TRITC-Phalloidin），以溶于甲醇的20μM儲存液形式提供，具體的工作濃度請參考文獻或自身實驗體系來調(diào)整，常用濃度范圍80-200nM。按照100nM的工作濃度來算，可進行300次細胞染色。

產(chǎn)品應(yīng)用：

1） 對固定的組織切片和組織細胞培養(yǎng)物進行肌動蛋白絲（F-actin）的熒光染色；

2） 體外制備穩(wěn)定的熒光肌動蛋白絲（F-actin）；

保存條件: 

-20℃避光保存，1年有效。

操作流程（免疫熒光染色）

有幾種方法都能用來染色組織細胞培養(yǎng)物內(nèi)的肌動蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細胞F-actin分布情況中至關(guān)重要。固定步驟基于實驗自身需求來選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

一、實驗材料準備

1.1 TRITC Phalloidin（Cat# NBS5832）

1.2 1.2 1 x PBS緩沖液（細胞培養(yǎng)級別）（Cat# NBS3021）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）（Cat# NBS0135）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑（Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032或DAPI Fluoromount-G 抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0033）

1.6 即用型DAPI染液（Cat# NBS1206）

1.7 （可選）牛血清白蛋白 (第五組分)（Bovine Serum Albumin，BSA）（Cat# NBS0218）

1.8 蓋玻片密封液（透明指甲油）

二、染色工作液準備

2.1 剛收到或第一次使用時，將充分融化的本品（20μM儲存液）根據(jù)單次使用量進行分裝，置于-20℃避光保存，一年穩(wěn)定。

2.2 正式實驗前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）稀釋儲存液到需要的工作濃度，常用的工作濃度范圍為80-200nM?？梢?span>100nM為起始工作濃度，最佳的工作濃度請參考文獻或根據(jù)實驗室現(xiàn)有體系來摸索。

【注①】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環(huán)肽粘附到管壁的可能性。

【注②】：染色工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫避光保存。

三、染色流程

3.1 細胞爬片培養(yǎng)，使其密度至少達半?yún)R合。

3.2 吸掉培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細胞2次。

 3.3用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細胞，室溫固定10min?！咀⒁狻浚汗潭ㄟ^程中甲醇能破壞肌動蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。最好的固定液是無甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5 用破膜緩沖液透化細胞，室溫處理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取200μl現(xiàn)配的TRITC-Phallodin染色工作液，完全覆蓋蓋玻片上的細胞，室溫避光孵育30min?！咀⒁狻浚和ǔＧ闆r4℃-37℃都適合用于染色。為了避免工作液的揮發(fā)，孵育過程將蓋玻片置于一密封的容器內(nèi)。

3.8 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9 取200μl DAPI溶液（100nM）或商業(yè)化的即用型DAPI染色液對細胞核復(fù)染，室溫約30s。

3.10 用1×PBS Buffer清洗細胞1-2次，室溫下30s/次。

3.11 將蓋玻片倒置在滴有一滴抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032）的載玻片上。用紙巾輕輕吸掉多余淬滅劑，然后用透明指甲油密封蓋玻片四周。將此法處理玻片置于4℃避光存放至少6個月仍能維持F-actin染色。

【可選】：完成步驟3.8后，直接將蓋玻片倒置在含DAPI的抗熒光淬滅劑（如DAPI Fluoromount-G 抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0033）的載玻片上。然后吸掉多余淬滅劑并用指甲油密封蓋玻片四周。

3.12 熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，選擇TRITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=546/575nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事項：

1.      本品具有一定的毒性，LD50=2mg/kg，操作時請注意防護。

2.      本品（Cat#NBS5832）以溶于甲醇的儲存液（20μM）形式提供，300T包裝，適合用量少的研究者；另提供凍干粉形式（Cat# NBS5833），1mg包裝，相對更經(jīng)濟，適合用量多的研究者；

3.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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