iFluor^TM 790 Phalloidin iFluor 790標(biāo)記鬼筆環(huán)肽

【溫馨提示】：見我司整理的鬼筆環(huán)肽及偶聯(lián)物（Phalloidin and Phalloidin Conjugates）產(chǎn)品專題。

產(chǎn)品簡介：

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin），又稱鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）中分離到的一種七肽毒素，以極高的親和力和特異性結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲F-actin（聚合形式的肌動(dòng)蛋白），不會結(jié)合單體肌動(dòng)蛋白（G-actin）。不像肌動(dòng)蛋白抗體，同時(shí)識別單體和聚合形式的肌動(dòng)蛋白。鬼筆環(huán)肽對大小纖維的親和力相近，在許多不同的動(dòng)植物物種的肌肉和非肌肉細(xì)胞中，基本都按照一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的化學(xué)計(jì)量比結(jié)合。不像肌動(dòng)蛋白抗體，對不同物種或來源的肌動(dòng)蛋白親和力會發(fā)生明顯變化。鬼筆環(huán)肽的非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色和未染色區(qū)域的差異極其明顯。鬼筆環(huán)肽使得肌動(dòng)蛋白聚合/解離的臨界濃度降至1μg/ml，可用作一種聚合增強(qiáng)劑。另外，產(chǎn)生的復(fù)合物高度穩(wěn)定（解離常數(shù)約3×10–8M），能夠抑制細(xì)胞松弛素、碘化鉀和溫度上升引起的去聚合和去組裝活性。

鬼筆環(huán)肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對F-actin染色，且水溶性良好，是非常實(shí)用和方便的探針，對組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞體系內(nèi)的F-actin進(jìn)行定性和定量研究。另外，鬼筆環(huán)肽及其衍生物很小，直徑約12–15 ?，分子量<2000 Da，經(jīng)標(biāo)記后的F-actin仍維持許多標(biāo)記前的功能。比如，標(biāo)記的甘油抽提肌纖維仍能收縮；標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲仍能在固相肌球蛋白基質(zhì)中移動(dòng)。

本品為iFluor 790熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（iFluor 790-Phalloidin），以凍干粉形式提供。按照100μl/孔（96孔板），總共可做300次。

產(chǎn)品特點(diǎn):

1.  選擇性染色F-actin，優(yōu)于抗體染色法，具更高的特異性和更低的非特異背景。

2.  優(yōu)秀的熒光亮度和穩(wěn)定性，類同于Alexa Fluor790-Phalloidin，Ex/Em=787/808nm。

3.  優(yōu)化用于固定和透化處理樣本。

4.  適用于多重標(biāo)記應(yīng)用，與其他熒光染料包括熒光蛋白、Qdot熒光納米晶和其他包括二抗在內(nèi)的熒光偶聯(lián)物完全兼容。

保存條件：

-20℃避光干燥保存，1年有效。

操作流程（免疫熒光染色）

有幾種方法都能用來染色組織細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)的肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細(xì)胞F-actin分布情況中至關(guān)重要。固定步驟基于實(shí)驗(yàn)自身需求來選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

1.1 iFluor 790 Phalloidin（Cat# NBS5841）

1.2 1.2 1 x PBS緩沖液（細(xì)胞培養(yǎng)級別）（Cat# NBS3021）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）（Cat# NBS0135）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑（Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032或DAPI Fluoromount-G 抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0033）

1.6 即用型DAPI染液（Cat# NBS1206）

1.7 （可選）牛血清白蛋白 (第五組分)（Bovine Serum Albumin，BSA）（Cat# NBS0218）

1.8  黑框/透明底的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板

二、染色工作液準(zhǔn)備

2.1 于實(shí)驗(yàn)前將低溫保存的iFluor 790Phalloidin置于室溫回溫至少20min，低速離心后才開瓶。

2.2 往瓶內(nèi)加入30μl高質(zhì)量無水DMSO，充分溶解，用槍吹勻，即得到1000×儲存液。按照單次用量進(jìn)行分裝，置于-20℃避光保存，至少6個(gè)月穩(wěn)定。

2.3 開始實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）將其稀釋到1×染色工作液（比如1μl儲存液加入1ml PBS Buffer），用槍吹勻即可。

【注①】：以96孔板為檢測體系，按照100μl/孔來計(jì)算，準(zhǔn)備足量的染色工作液；也可對細(xì)胞爬片進(jìn)行染色，但需調(diào)整染色工作液的用量，以能覆蓋住細(xì)胞為準(zhǔn)。

【注②】：最佳的工作濃度和孵育時(shí)間取決于特定的應(yīng)用。根據(jù)特定的細(xì)胞類型和/或細(xì)胞/組織對探針的通透性來調(diào)整合適的染色條件。

【注③】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環(huán)肽粘附到管壁的可能性。

【注④】：染色工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫避光保存。

三、染色流程（以96孔板為例）

3.1 用黑框/透明底的96孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使其貼壁生長達(dá)到70-80%的匯合度。

3.2 吸掉培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。

3.3 用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫固定10-30min?！咀⒁狻浚汗潭ㄟ^程中甲醇能破壞肌動(dòng)蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。最好的固定液是無甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5 用破膜緩沖液透化細(xì)胞，室溫處理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取100μl現(xiàn)配的iFluor 790Phalloidin染色工作液到每個(gè)孔內(nèi)，室溫避光孵育30-90min。

【注意】：若有需要，此時(shí)可加入即用型DAPI染色液或其他不同于iFluor 790熒光光譜的細(xì)胞核染色液。

3.8 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9 加抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032）到孔內(nèi)保護(hù)熒光。

3.10 熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，選擇iFluor 790激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=787/808nm）。若做細(xì)胞核染色，選擇合適濾片，比如DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事項(xiàng)：

1.      本品具有一定的毒性，LD50=2mg/kg，操作時(shí)請注意防護(hù)。

2.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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