Calcein, AM, Ultra Pure Grade 鈣黃綠素（綠色，超純級別）

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產(chǎn)品簡介：

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細(xì)胞膜滲透性的活細(xì)胞熒光染料，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基團的存在不僅加強疏水性，使其能輕易穿透活細(xì)胞膜。而且封閉結(jié)合鈣離子的分子部分，本身不發(fā)熒光。一旦進入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解為鈣黃綠素（calcein），能與胞內(nèi)鈣離子結(jié)合，產(chǎn)生強烈的綠色熒光。因不具有細(xì)胞膜滲透性，從而被保留在胞內(nèi)。與其它活細(xì)胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein, AM最適合用于活細(xì)胞染色探針，因細(xì)胞毒性很低，而且不會抑制任何細(xì)胞功能如增殖或淋巴細(xì)胞趨化性。另外，使用Calcein, AM活性檢測的實驗結(jié)果十分可信，與標(biāo)準(zhǔn)的51Cr釋放法所得結(jié)果一致。

由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅對活細(xì)胞進行標(biāo)記，這一特征使其非常適合用來檢測細(xì)胞活力和細(xì)胞的短期示蹤。常常與碘化丙啶PI聯(lián)合使用，因其僅能穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域到達(dá)細(xì)胞核，嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋區(qū)域，并產(chǎn)生紅色熒光（Ex/Em= 535nm/617nm），僅對死細(xì)胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。結(jié)合這些特點，Calcein, AM和PI經(jīng)常被結(jié)合用作活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。

本品以粉末形式提供，超純級別（≥95%），可與碘化丙啶PI（貨號：NBS1207-10MG）聯(lián)合使用，進行活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。

產(chǎn)品特性：

1） CAS NO：148504-34-1

2） 同義名：鈣黃綠素乙酰甲酯；3'-O-乙酰胺-2',7'-二(羧乙基)-4或5-羧基熒光素，二乙酰甲酯；

3） 分子式：C46H46N2O23

4） 分子量：994.86

5） 純度：≥95%（HPLC）

6） 外觀：白色或淺黃色結(jié)晶粉末

7） 溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

保存條件: 

-20℃干燥保存，避免強光直射，有效期一年。

產(chǎn)品使用：

A， 儲存液制備

儲存液配制范圍可為1～5 mM，具體根據(jù)工作濃度來決定，建議提前配制成1000×儲存液。若使用的工作液為5μM，那么可配制5mM的儲存液，即往50μg Calcein，AM（Mw：994.86）內(nèi)加入10μl 細(xì)胞培養(yǎng)級別的DMSO即可。

B， 20% Pluronic F-127制備【可選】

稱取100mg Pluronic F-127（CAT NO. NBS2009）粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

C， 染色步驟

大多數(shù)實驗體系中Calcein, AM的工作濃度為2-5μM。由于不同細(xì)胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定Calcein, AM的最佳工作濃度，以最低的探針濃度得到最好的熒光結(jié)果為篩選原則。

1） 取一管適量分裝的儲存液（1000×）置于室溫，至少回溫20min，低速離心后，用合適的緩沖液如PBS，HBSS-HEPES稀釋到1×染色工作液。

【注意】：有時可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein AM儲存液內(nèi)來增強其水溶性。制備染色工作液前，取一管Calcein AM儲存液內(nèi)加入等體積的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。加入Pluronic F127的Calcein AM溶液不可長期保存，需現(xiàn)配現(xiàn)用。

2） 對于貼壁細(xì)胞，先用胰酶-EDTA消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3min）。對于懸浮細(xì)胞，直接離心收集細(xì)胞。

3） 去上清，用PBS（或者其他緩沖液）清洗細(xì)胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

4） 用1/10細(xì)胞培養(yǎng)基體積的Calcein, AM染色工作液重懸細(xì)胞，37℃孵育15～30min。

【注意】：若細(xì)胞自身含有機陰離子轉(zhuǎn)運體，需加入丙磺舒（CAT NO. NBS2007）（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育體系內(nèi)以降低Calcein泄露到胞外。

5） 用PBS（或者其他緩沖液）洗滌細(xì)胞兩次去除多余染料。

【注意】：如有必要，使用含有機陰離子轉(zhuǎn)運抑制劑的緩沖液來進行細(xì)胞清洗。用含合適濾光片（Ex/Em= 490nm/515nm）的熒光顯微鏡進行檢測。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Calcein-AM對濕度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein-AM儲存液需要分裝避光凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein-AM工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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