Calcein Deep Red AM 鈣黃綠素深紅乙酰氧基甲酯

產(chǎn)品簡介：

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細(xì)胞膜滲透性最受歡迎的活細(xì)胞熒光染料，用來標(biāo)記和監(jiān)測活細(xì)胞功能，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。然而，Calcein, AM單一顏色使其不能將其用在多重標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，比如，其無法和GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞聯(lián)合使用，因光譜一致。為了解決這一應(yīng)用缺陷，我司特別開發(fā)出Calcein Red（CAT NO.：NBS2016），Calcein Deep Red（CAT NO.：NBS2019）這些衍生物，能夠聯(lián)合GFP或FITC等熒光素實(shí)現(xiàn)對活細(xì)胞的多重標(biāo)記和功能分析。

鈣黃綠素深紅乙酰氧基甲酯（Calcein Deep Red AM）自身無熒光，具有細(xì)胞膜滲透性。能夠輕易進(jìn)入活細(xì)胞，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解生成鈣黃綠素深紅（Calcein Deep Red），產(chǎn)生強(qiáng)烈的深紅色熒光（Ex/Em=643/663nm），用標(biāo)準(zhǔn)的Cy5濾片設(shè)置檢測。

產(chǎn)品特性:

1）  同義名：Calcein Deep Red AM；Calcein Deep Red AM Ester;鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（深紅色），鈣黃綠素深紅乙酰氧基甲酯；

2）  分子量：~600

3）  純度：≥95%（HPLC）

4）  Ex/Em：643/663nm

5）  溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

保存條件: 

-20℃干燥保存，避免強(qiáng)光直射，有效期一年。

應(yīng)用實(shí)例:

Fig 1.HeLa細(xì)胞（活細(xì)胞+固定細(xì)胞）經(jīng)Calcein Deep Red AM（CAT NO.：NBS2019）染色的圖片。

產(chǎn)品使用：

1、儲存液制備

儲存液配制范圍可為2～5 mM，具體根據(jù)工作濃度來決定，建議提前配制成1000×儲存液。若使用的工作液為5μM，那么可配制5mM的儲存液，即往1mg Calcein Deep RedAM（Mw ~600）內(nèi)加入333μl細(xì)胞培養(yǎng)級別的DMSO即可。儲存液需要根據(jù)單次用量分裝，-20℃避光干燥保存，一定要避免受潮，此種情況下可穩(wěn)定保存數(shù)月。

2、染色工作液制備

于正式實(shí)驗(yàn)前，或溶解Calcein Deep RedAM粉末配制儲存液，或取一管已配制好的Calcein Deep RedAM儲存液并回至室溫使充分融化。用添加有2.5mM 丙磺舒（CAT NO. NBS2007）的HHBS（Hanks with 20mM Hepes buffer）或其他適當(dāng)?shù)木彌_液（pH 7.0）稀釋儲存液到5~10 μM工作濃度。

【注1：Calcein Deep Red染色工作液很不穩(wěn)定，需要使用前配制?！?/span>

【注2：許多細(xì)胞都含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體。因此高度推薦染色工作液內(nèi)添加2.5mM丙磺舒（有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑），以防止熒光探針泄露到細(xì)胞外。】

3、染色步驟

以下是基于96孔板的Calcein Deep Red活細(xì)胞染色步驟，僅作參考。具體實(shí)驗(yàn)請根據(jù)自身要求做調(diào)整。

a. 細(xì)胞準(zhǔn)備：于黑框/透明底的96孔微孔板內(nèi)按照100~10,000個細(xì)胞/孔的量鋪板。設(shè)置空白孔（不含細(xì)胞的培養(yǎng)基）?！咀⒁狻浚好糠N細(xì)胞系需要根據(jù)實(shí)際情況來確認(rèn)細(xì)胞增殖或細(xì)胞毒性誘導(dǎo)的最佳細(xì)胞密度。增殖分析，細(xì)胞密度相對少些；毒性分析，起始細(xì)胞密度高些。建議96孔板的單孔體積為100 μL。

b. 藥物處理：加待測藥物到細(xì)胞內(nèi)處理適當(dāng)時間（比如24h，48h或96h）。設(shè)置空白孔（不含細(xì)胞的培養(yǎng)基），加入相應(yīng)量的待測藥物?！咀⒁狻浚核幬锾砑忧翱刹挥们逑醇?xì)胞。然而，若是藥物是血清敏感性，那在添加藥物前需要吸掉生長培養(yǎng)基和血清因子。替換之細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。

c. 吸掉培養(yǎng)基?！咀⒁狻浚禾结樇虞d前必須去除培養(yǎng)基。

d. 按照100 μL/孔（96孔板）的量加入Calcein Deep Red染色工作液。

e. 室溫或37℃避光孵育1h。

【注意1】：適當(dāng)?shù)姆跤龝r間取決于細(xì)胞類型和使用的細(xì)胞濃度。每個實(shí)驗(yàn)建議進(jìn)行孵育時間優(yōu)化。

【注意2】：對于懸浮細(xì)胞，探針孵育結(jié)束后，于800rpm離心2min。

f. 用含合適濾光片（Ex/Em= 643nm/663nm）的儀器進(jìn)行熒光檢測。【注意：如果熒光背景高，可在熒光信號檢測前用含2.5mM丙磺舒的HHBS緩沖液替換Calcein Deep Red染色工作液?！?/span>

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請?jiān)诟稍锏沫h(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Calcein Red AM對濕度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein Red AM儲存液需要分裝避光凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein Red AM工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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