羅丹明123線粒體膜電位檢測試劑盒

Rhodamine 123 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit

產(chǎn)品簡介：

羅丹明123線粒體膜電位檢測試劑盒（Rhodamine 123 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一種以羅丹明123為熒光探針，快速且靈敏的檢測細(xì)胞或純化線粒體膜電位變化的試劑盒。因線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。因此本試劑盒可用于早期的細(xì)胞凋亡檢測。

羅丹明123（Rhodamine 123，簡寫：Rh123），一種細(xì)胞膜滲透性的陽離子熒光探針，一種線粒體跨膜電位的指示劑。羅丹明123快速穿透細(xì)胞膜，僅需幾分鐘就可以被具有活性的線粒體所俘獲，且對細(xì)胞沒有任何毒性。最大激發(fā)波長為507nm，最大發(fā)射波長為529nm。熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光，也可用熒光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，通過熒光信號的強弱來判斷線粒體膜電位的變化和凋亡或壞死的發(fā)生。

羅丹明123檢測線粒體膜電位的原理在于：正常細(xì)胞中，羅丹明1223依賴線粒體跨膜電位（ΔΨm）選擇性進入線粒體基質(zhì)，可發(fā)出明亮的黃綠色熒光；當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，線粒體膜電位喪失，線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔持續(xù)開放，引起線粒體膜電位的崩潰，羅丹明123從線粒體中釋放出來，從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)黃綠色熒光強度的明顯降低。需注意，有文獻報道在某些特定情況下，羅丹明123在線粒體內(nèi)過度聚集后可能出現(xiàn)自淬滅現(xiàn)象，線粒體內(nèi)黃綠色熒光強度降低；而在凋亡發(fā)生時，線粒體中黃綠色熒光增強。

保存條件: 

-20℃避光保存，1年有效。

產(chǎn)品組成：

需要自備的儀器和試劑：

1） 流式細(xì)胞儀、熒光光度計、熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡（激發(fā)波長：488-505nm，發(fā)射波長：515-575nm，一般為529nm）。

2）【可選】線粒體提取試劑及其配套儀器   

3）1.5ml微量離心管    

4）載玻片   

5）無菌雙蒸水

產(chǎn)品使用：

1、試劑準(zhǔn)備

于正式實驗前，取適量低溫保存的染色緩沖液（5×）用無菌雙蒸水稀釋到1×，待用。（比如：1ml染色緩沖液（5×）加入4ml雙蒸水，混勻即可）。

2、細(xì)胞染色及分析

2.1收集培養(yǎng)細(xì)胞調(diào)整其密度為1×10⁶/ml，重懸于培養(yǎng)基中；

2.2加入羅丹明123染液（1mg/ml） 使其濃度為：0.1 - 50 μg/ml（根椐細(xì)胞種類不同而濃度不同，一般染色濃度為3 - 10 μg/ml）；

2.3 37℃孵育1 - 30 min（根椐細(xì)胞種類不同而不同，一般染色時間為10 min）；

2.4離心后用培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次；

2.5重懸細(xì)胞于培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)60 min；

2.6根據(jù)實驗需求，選擇合適的儀器檢測：

① 流式細(xì)胞儀檢測：激發(fā)波長488-505nm，發(fā)射波長515-575 nm（一般為529nm）；

② 熒光顯微鏡觀察：滴加100 μl上述混合液于載玻片上，激發(fā)濾片波長488nm，發(fā)射波長為529nm觀察。

3、線粒體染色及分析

3.1按照常規(guī)方法提取線粒體（或根據(jù)商業(yè)化的線粒體提取試劑盒來操作），之后用適量的1×染色緩沖液重懸線粒體；

3.2按照常規(guī)方法進行蛋白含量測定，之后用1×染色緩沖液調(diào)配成3mg/ml蛋白濃度的線粒體溶液；

3.3取2ml 1×染色緩沖液和1ml線粒體溶液；

3.4加入適量待測化合物（同時設(shè)置陰性對照組），25℃孵育3min；

3.5加入10μl羅丹明123染液；

3.6用熒光光度計來檢測：將上述混合液全部加入石英比色皿中，置于25℃測定，激發(fā)波長488-505nm，發(fā)射波長529nm，連續(xù)記錄從0-30min內(nèi)熒光強度的變化。亦可以用熒光酶標(biāo)儀來檢測，激發(fā)波長為507nm，發(fā)射波長為529nm；或在軟件中將檢測對象設(shè)置為FITC，即可檢測羅丹明123的信號。

4、熒光觀測和結(jié)果分析

羅丹明123的最大激發(fā)波長為507nm，最大發(fā)射波長為529nm。如使用熒光顯微鏡觀察，可以參考觀察FITC等其它綠色熒光檢測時的設(shè)置。黃綠色熒光變?nèi)?，說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。通過對比實驗組與陰性對照組測量的相對熒光值（Relative fluorescence values, RFU），可得出藥物處理后線粒體內(nèi)羅丹明123熒光強度的變化。此處的陰性對照組為僅含染色緩沖液未經(jīng)染色的細(xì)胞樣品。

注意事項：

1.      羅丹明123染液（1mg/ml）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2.      本試劑盒僅適用于活細(xì)胞或分離線粒體的檢測，不可用于固定或凍存的細(xì)胞或組織樣本的檢測。

3.      熒光酶標(biāo)儀檢測時須使用適合熒光檢測的黑板或白板。

4.      如實驗需要，可選擇CCCP或FCCP用作陽性對照，誘導(dǎo)線粒體膜電位喪失。

5.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

6.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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