Fluo-8, AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針，超級(jí)純

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強(qiáng)烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Fluo-8，是目前最亮的可見(jiàn)光激發(fā)波長(zhǎng)Ca²⁺熒光探針，其熒光強(qiáng)度比Fluo-4強(qiáng)兩倍，比Fluo-3強(qiáng)四倍。Fluo-8具中等程度的Ca²⁺親和力，幾乎接近Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM），使用上幾乎同Fluo-3和Fluo-4。

Fluo-8不僅維持Fluo-3，Fluo-4便捷的光譜檢測(cè)特性，與Ca²⁺結(jié)合后的最大激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為514nm。而且具有改善的細(xì)胞載入和Ca²⁺響應(yīng)能力。Fluo-8加載具較弱的溫度依賴性，在室溫或37℃孵育皆染色良好，不像Fluo-3，Fluo-4嚴(yán)格要求在37℃孵育，此特征使其更適用于HTS高通量篩選實(shí)驗(yàn)。Fluo-8應(yīng)用廣泛，與許多細(xì)胞系和靶向樣本兼容，不會(huì)受配體或靶標(biāo)本身信號(hào)干擾。Fluo-8可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡等來(lái)檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子水平的變化。

Fluo-8, AM是Fluo-8的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fluo-8，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。本品以50μg小包裝的凍干粉形式供貨，用于細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺水平檢測(cè)時(shí)，常用濃度為1-5μM。

基本特性：

1）同義名：Fluo-8, Acetoxymethyl Ester;Fluo-2, AM; Fluo-2 Medium Affinity, Acetoxymethyl Ester;

2）化學(xué)名：Bis(acetoxymethyl) 2,2'-((4-(6-(acetoxymethoxy)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-2-(2-(bis(2-acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)phenoxy)ethoxy)phenyl)azanediyl)diacetate

3）分子式：C50H50N2O23

4）分子量：1046.93

5）最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：490/514 nm（Ca²⁺結(jié)合）

6）溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期一年。

產(chǎn)品使用： 【注意】以下使用方法僅用作參考，可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件做出調(diào)整。

A、試劑準(zhǔn)備

1. 配制Pluronic F-127母液：稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號(hào)：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2. HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3)或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1. 用無(wú)水DMSO溶解Fluo-8, AM配制成1-5mM的儲(chǔ)存液，或?qū)⒁雅浜玫?span>Fluo-8, AM儲(chǔ)存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fluo-8,AM中加入11.9μl無(wú)水DMSO）。

2. 用HHBS或其他生理緩沖液將Fluo-8, AM+DMSO儲(chǔ)存液稀釋到1-10μM的工作液，提前加入適量的20% Pluronic F-127溶液，使其終濃度為0.02%。

【注①】：Fluo-8, AM應(yīng)用在大部分細(xì)胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Fluo-8, AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

【注③】：Pluronic F-127可以防止Fluo-8, AM在溶液中聚合并促使探針更好進(jìn)入細(xì)胞。但Pluronic F-127可降低Fluo-8, AM的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議加入儲(chǔ)存液長(zhǎng)期保存。

3.【可選】如果細(xì)胞內(nèi)含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮儲(chǔ)存液相當(dāng)偏堿，因此加入培養(yǎng)基后需要重新調(diào)整pH。

4. 將準(zhǔn)備好的Fluo-8, AM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。37℃或者室溫孵育20-60min。

【注①】：關(guān)于孵育的時(shí)間，如果首次做實(shí)驗(yàn)不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時(shí)間；如果熒光強(qiáng)度太弱，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

【注②】：降低探針加載溫度可能會(huì)降低探針的區(qū)室化現(xiàn)象。

5. 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑如2.5mM丙磺酸的緩沖液）替換，以去除多余探針。

6. 用適當(dāng)?shù)膬x器如激光共聚焦、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀，以及波長(zhǎng)Ex/Em=490/520 nm來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

【注①】：Fluo-8, AM進(jìn)入胞內(nèi)后，經(jīng)酯酶降解形成Fluo-8，并不是以共價(jià)結(jié)合的形式滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。因此不可對(duì)加載染料的活細(xì)胞進(jìn)行固定處理，再進(jìn)行Ca²⁺水平檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請(qǐng)?jiān)诟稍锏沫h(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請(qǐng)將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Fluo-8, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Fluo-8, AM第一次使用，建議儲(chǔ)存液現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝成單次用量，嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實(shí)驗(yàn)效果，盡量在短時(shí)間內(nèi)使用。

5.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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