Indo-1, AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針，超級純（95%）

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品簡介：

Indo-1是一種常用的紫外光激發(fā)和比率測定型Ca²⁺熒光探針。一旦與Ca²⁺結(jié)合后，Indo-1的最大發(fā)射波長向短波長遷移，由原來的475nm（Ca²⁺-free）遷移到401nm（Ca²⁺-saturated），而最大激發(fā)波長無明顯變化，維持在346nm~330nm范圍內(nèi)，適宜用氬離子激發(fā)器的UV激發(fā)光譜（351~364nm）進(jìn)行熒光激活。因此，不同于Fura-2，Indo-1是發(fā)射波長率圖Ca²⁺熒光探針，特別適合流式細(xì)胞儀檢測，因其可在控制單一激發(fā)波長的條件下輕易調(diào)整發(fā)射濾片，也特別適合多色熒光檢測。使用發(fā)射波長下熒光強度的比率來測定細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度，可消除不同細(xì)胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，探針的滲漏，細(xì)胞厚度差異等因素導(dǎo)致的檢測誤差。實際檢測，推薦使用最大發(fā)射波長分別用405nm和485nm。

Indo-1, AM是Indo-1的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Indo-1，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。

基本特性：

1） CAS NO：112926-02-0

2） 化學(xué)名：1H-Indole-6-carboxylic acid, 2-[4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2- [(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]phenyl]-, (acetyloxy)methyl ester

3） 同義名：Indo-1, Acetoxymethyl Ester; Indo-1, AM ester; Indo-1 AM Calcium Sensor Dye;

4） 分子式：C₄₇H₅₁N₃O₂₂

5） 分子量：1009.91

6） 純度：≥95% (HPLC)

7） 外觀：黃色固體

8） 解離常數(shù)（Kd）：230nM

9） 消光系數(shù)：33000 cm^-1 M^-1

10） Ex/Em：346/475 nm（Ca²⁺-free），330/401 nm（Ca²⁺-saturated）

11） 溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

Indo-1, AM激發(fā)光譜圖

Description： Fluorescence emission spectra of indo-1 (NBS7644) in solutions containing 0–39.8 μM free Ca²⁺. 

保存條件: 

4℃保存（一年有效）

產(chǎn)品使用：

A， 試劑準(zhǔn)備

1） 配制Pluronic F-127母液： 稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1）. Indo-1/AM 儲存液的配制 利用高質(zhì)量無水DMSO溶解Indo-1/AM配制成2-5mM的儲存液，該儲存液可分裝于-20℃避光干燥密封保存，最長可保存6個月，但是避免反復(fù)凍融，建議分裝保存。每次使用前需回溫至室溫。

2）. Indo-1/AM 工作液的配制 利用合適緩沖液（如HHBS）將Indo-1/AM稀釋成2-20μM的工作液，并添加0.04%PluronicF-127和有機陰離子轉(zhuǎn)運抑制劑probenecid（0.5-1mM）。 【注①】： 對于大多數(shù)細(xì)胞系，建議最終濃度為4-5 μM的Indo-1/AM。細(xì)胞加載所需的指示劑的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗確定。

【注②】： Indo-1/AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

【注③】： PluronicF-127 可以防止Indo-1/AM在緩沖液中聚合并能幫助其進(jìn)入細(xì)胞。

3）. 取出預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，使用緩沖液洗滌細(xì)胞3次。

【注①】：如果使用含血清的培養(yǎng)基，血清中的酯酶會降低Indo-1/AM進(jìn)入細(xì)胞的效果。另外含有酚紅的培養(yǎng)基會使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)基殘留。

4）. 將 Indo-1/AM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。在37℃培養(yǎng)30-60min。

5）. 用緩沖液（如HHBS）洗滌細(xì)胞3次，以充分去除殘留的Indo-1/AM工作液。然后加入緩沖液覆蓋細(xì)胞。

6）. 數(shù)字成像顯微鏡檢測細(xì)胞。

【注①】：某些細(xì)胞具有自體熒光會影響結(jié)果分析，需使用未加載探針細(xì)胞做對照，在結(jié)果分析時在同一波長下扣除自熒光。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Indo-1, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Indo-1, AM第一次使用，建議儲存液現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝成單次用量，嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實驗效果，盡量在短時間內(nèi)使用。

5.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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