Fura-2, AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針，超級(jí)純（95%）

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強(qiáng)烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Fura-2是一種常用的紫外光激發(fā)和比率測(cè)定型Ca²⁺熒光探針。一旦與Ca²⁺結(jié)合后，Fura-2的最大激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)色遷移，由原來(lái)的363nm（Ca²⁺-free）遷移到335nm（Ca²⁺-saturated），而最大發(fā)射波長(zhǎng)基本未變化，保持在510nm左右。通常情況，分別用最大激發(fā)波長(zhǎng)340nm和380nm來(lái)激發(fā)Fura-2，且用340/380nm激發(fā)下的熒光比值來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度。使用比值檢測(cè)，可消除不同細(xì)胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，探針的滲漏，細(xì)胞厚度差異等因素導(dǎo)致的檢測(cè)誤差。Fura-2自1985年合成以來(lái)，廣泛用于各種細(xì)胞系統(tǒng)和生化用途，特別是數(shù)字顯微成像。單波長(zhǎng)檢測(cè)，Fura-2與Ca²⁺結(jié)合后，推薦用最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為340nm和510nm；雙波長(zhǎng)檢測(cè)，則推薦用最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為340nm和380nm；
    Fura-2, AM是Fura-2的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fura-2，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。本品以凍干粉的形式提供，使用時(shí)只需經(jīng)無(wú)水DMSO充分溶解，配置成1~5mM的儲(chǔ)存液，并稀釋到合適的工作濃度即可。進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺檢測(cè)，Fura-2, AM的常用濃度為0.5~5μM。

產(chǎn)品特性：

1）CAS NO：108964-32-5

2）同義名：Fura-2, Acetoxymethyl Ester

3）分子式：C₄₄H₄₇N₃O₂₄

4）分子量：1001.86

5）純度：≥95% (HPLC)

6）外觀：黃色粉末

7）最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：363/512 nm（Ca²⁺-free），335/505 nm（Ca²⁺-saturated）

8）溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

Fura-2, AM激發(fā)光譜圖：

Description：Fluorescence excitation spectra of fura-2 (NBS7642) in solutions containing 0–39.8 μM free Ca²⁺.

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

產(chǎn)品使用：

A， 試劑準(zhǔn)備

1） 配制Pluronic F-127母液： 稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號(hào)：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1） 用無(wú)水DMSO溶解Fura-2, AM配制成1-5mM的儲(chǔ)存液，或?qū)⒁雅浜玫?span>Fura-2, AM儲(chǔ)存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fura-2, AM中加入12.5μl 無(wú)水DMSO）。準(zhǔn)備Fura-2, AM工作液之前，有時(shí)需要往Fura-2, AM儲(chǔ)存液中加入適量的20% Pluronic F-127溶液，以增強(qiáng)AM探針的水溶性。

【注①】：Fura-2, AM染色工作液制備前，添加等體積20% Pluronic F-127溶液到Fura-2, AM+DMSO儲(chǔ)存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進(jìn)入細(xì)胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議加入儲(chǔ)存液長(zhǎng)期保存。

2） 用HHBS或其他生理緩沖液將 Fura-2, AM+DMSO儲(chǔ)存液稀釋到0.1-5μM的工作液。

【注①】：Fura-2, AM應(yīng)用在大部分細(xì)胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Fura-2, AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

3） 【可選】如果細(xì)胞內(nèi)含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone， 0.1-0.25mM）可能需要加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮儲(chǔ)存液相當(dāng)偏堿，因此加入培養(yǎng)基后需要重新調(diào)整pH。

4） 將準(zhǔn)備好的Fura-2, AM染色工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。37℃孵育20-60min。

【注①】：若使用含血清的培養(yǎng)基，血清內(nèi)酯酶會(huì)降解AM，從而降低Fura-2, AM加載效果。而含酚紅培養(yǎng)基會(huì)使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對(duì)細(xì)胞清洗2~3次。

【注②】：關(guān)于孵育的時(shí)間，如果首次做實(shí)驗(yàn)不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時(shí)間；如果熒光強(qiáng)度太弱，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

【注③】：降低探針加載溫度可能會(huì)降低探針的區(qū)室化現(xiàn)象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑如2.5mM丙磺酸的緩沖液）清洗細(xì)胞1~2次，以去除殘留探針。

6） 37℃再孵育30min以保證細(xì)胞內(nèi)AM的完全去酯化。

7） 用熒光顯微鏡、熒光分光光度計(jì)或其他熒光檢測(cè)設(shè)備，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請(qǐng)?jiān)诟稍锏沫h(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請(qǐng)將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Fura-2, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Fura-2, AM第一次使用，建議儲(chǔ)存液現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝成單次用量，嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實(shí)驗(yàn)效果，盡量在短時(shí)間內(nèi)使用。

5.      Fura-2, AM具有相對(duì)較強(qiáng)的抗光淬滅能力，細(xì)胞孵育后1h內(nèi)觀察，都不會(huì)因熒光泄露和光漂白作用導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果發(fā)生明顯變化。

6.      Fura-2不適合用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，因很難用它們完成激發(fā)光譜的快速轉(zhuǎn)換。

7.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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