Fura-2, AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針，標準純（90%）

【務必注意】：初次使用離子探針的用戶，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細胞培養(yǎng)級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內加載性。 

產品簡介：

Fura-2是一種常用的紫外光激發(fā)和比率測定型Ca²⁺熒光探針。一旦與Ca²⁺結合后，Fura-2的最大激發(fā)波長發(fā)生藍色遷移，由原來的363nm（Ca²⁺-free）遷移到335nm（Ca²⁺-saturated），而最大發(fā)射波長基本未變化，保持在510nm左右。通常情況，分別用最大激發(fā)波長340nm和380nm來激發(fā)Fura-2，且用340/380nm激發(fā)下的熒光比值來檢測細胞內Ca²⁺濃度。使用比值檢測，可消除不同細胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，探針的滲漏，細胞厚度差異等因素導致的檢測誤差。Fura-2自1985年合成以來，廣泛用于各種細胞系統(tǒng)和生化用途，特別是數字顯微成像。單波長檢測，Fura-2與Ca²⁺結合后，推薦用最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為340nm和510nm；雙波長檢測，則推薦用最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為340nm和380nm；
    Fura-2, AM是Fura-2的一種乙酰甲酯衍生物，具有細胞膜滲透性，只需簡單培養(yǎng)，即可輕易進入細胞。一旦進入細胞內，即被其內酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fura-2，從而滯留在胞內以發(fā)揮相應生理功能。本品以凍干粉的形式提供，使用時只需經無水DMSO充分溶解，配置成1~5mM的儲存液，并稀釋到合適的工作濃度即可。進行細胞內Ca²⁺檢測，Fura-2, AM的常用濃度為0.5~5μM。

產品特性：

1）CAS NO：108964-32-5

2）同義名：Fura-2, Acetoxymethyl Ester

3）分子式：C₄₄H₄₇N₃O₂₄

4）分子量：1001.86

5）純度：≥95% (HPLC)

6）外觀：黃色粉末

7）最大激發(fā)/發(fā)射波長：363/512 nm（Ca²⁺-free），335/505 nm（Ca²⁺-saturated）

8）溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

Fura-2, AM激發(fā)光譜圖：

Description：Fluorescence excitation spectra of fura-2 (NBS7643) in solutions containing 0–39.8 μM free Ca²⁺.

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

產品使用：

A， 試劑準備

1） 配制Pluronic F-127母液： 稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1） 用無水DMSO溶解Fura-2, AM配制成1-5mM的儲存液，或將已配好的Fura-2, AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fura-2, AM中加入12.5μl 無水DMSO）。準備Fura-2, AM工作液之前，有時需要往Fura-2, AM儲存液中加入適量的20% Pluronic F-127溶液，以增強AM探針的水溶性。

【注①】：Fura-2, AM染色工作液制備前，添加等體積20% Pluronic F-127溶液到Fura-2, AM+DMSO儲存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進入細胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議加入儲存液長期保存。

2） 用HHBS或其他生理緩沖液將 Fura-2, AM+DMSO儲存液稀釋到0.1-5μM的工作液。

【注①】：Fura-2, AM應用在大部分細胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據實驗要求進行優(yōu)化。為了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Fura-2, AM工作液需現配現用，避免反復凍存。

3） 【可選】如果細胞內含有機陰離子轉運體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone， 0.1-0.25mM）可能需要加入細胞培養(yǎng)基內，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮儲存液相當偏堿，因此加入培養(yǎng)基后需要重新調整pH。

4） 將準備好的Fura-2, AM染色工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。37℃孵育20-60min。

【注①】：若使用含血清的培養(yǎng)基，血清內酯酶會降解AM，從而降低Fura-2, AM加載效果。而含酚紅培養(yǎng)基會使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對細胞清洗2~3次。

【注②】：關于孵育的時間，如果首次做實驗不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細胞死亡較多，適當縮短時間；如果熒光強度太弱，適當延長時間。

【注③】：降低探針加載溫度可能會降低探針的區(qū)室化現象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如2.5mM丙磺酸的緩沖液）清洗細胞1~2次，以去除殘留探針。

6） 37℃再孵育30min以保證細胞內AM的完全去酯化。

7） 用熒光顯微鏡、熒光分光光度計或其他熒光檢測設備，根據實驗要求選擇合適的波長進行檢測。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Fura-2, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Fura-2, AM第一次使用，建議儲存液現配現用，分裝成單次用量，嚴格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實驗效果，盡量在短時間內使用。

5.      Fura-2, AM具有相對較強的抗光淬滅能力，細胞孵育后1h內觀察，都不會因熒光泄露和光漂白作用導致測定結果發(fā)生明顯變化。

6.      Fura-2不適合用激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測，因很難用它們完成激發(fā)光譜的快速轉換。

7.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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