Rhod-5N AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強(qiáng)烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

與其它基于BAPTA結(jié)構(gòu)的指示劑相比，Rhod-5N顯示出更低的鈣離子親和力（Kd=~320 μM），適用于濃度在10μM~1mM的鈣離子測(cè)定。與母本Rhod-2指示劑類似，Rhod-5N在不含二價(jià)陽(yáng)離子的情況下基本無(wú)熒光，一旦與鈣離子結(jié)合后，呈現(xiàn)出顯著的熒光增加，光譜基本無(wú)遷移。低親和鈣離子指示劑特別適合于具高濃度鈣離子的細(xì)胞區(qū)室研究，比如：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在這種區(qū)室內(nèi)高親和探針對(duì)腔室鈣水平變化不敏感。

Rhod-5N AM是Rhod-5N的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Rhod-5N，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。本品以凍干粉的形式提供，使用時(shí)只需經(jīng)無(wú)水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的儲(chǔ)存液，并依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)資料調(diào)整到需要的工作濃度即可。

產(chǎn)品特性

1）  化學(xué)名：N-(9-(4-(bis(2-(acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)-3-(2-(2-(bis(2-(acetoxymethoxy)-2-oxoethyl) amino)-5-nitrophenoxy)ethoxy)phenyl)-6-(dimethylamino)-3H-xanthen-3-ylidene)-N-methylmethanaminium bromide

2）  同義名：Rhod-5N, Acetoxymethyl Ester

3）  分子式：C51H56N5O11Br

4）  分子量：1154.92

5）  Ex/Em（Ca²⁺結(jié)合）：551/576 nm

6）  Kd（Ca²⁺結(jié)合，不含鎂離子的緩沖液）：~320 μM

7）  溶解性：溶于DMSO（2~5mM）

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

產(chǎn)品使用：

A，試劑準(zhǔn)備

1）配制Pluronic F-127母液：稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號(hào)：NBS2009-1g）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2）HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2)或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1） 用無(wú)水DMSO溶解Rhod-5NAM配制成2-5mM的儲(chǔ)存液，或?qū)⒁雅浜玫?span>Rhod-5NAM儲(chǔ)存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向1mgRhod-5NAM中加入216.4 μl無(wú)水DMSO）。準(zhǔn)備Rhod-5NAM工作液之前，有時(shí)需要往Rhod-5NAM儲(chǔ)存液中加入適量的20% Pluronic F-127溶液，以增強(qiáng)AM探針的水溶性。

【注①】：Rhod-5NAM染色工作液制備前，添加適量體積20% Pluronic F-127溶液到Rhod-5NAM + DMSO儲(chǔ)存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進(jìn)入細(xì)胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議加入儲(chǔ)存液長(zhǎng)期保存。

2） 用HHBS或其他生理緩沖液將Rhod-5NAM +DMSO儲(chǔ)存液稀釋到1-10μM的工作液。

【注①】：Rhod-5NAM應(yīng)用在大部分細(xì)胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Rhod-5NAM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

3）【可選】如果細(xì)胞內(nèi)含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮儲(chǔ)存液相當(dāng)偏堿，因此加入培養(yǎng)基后需要重新調(diào)整pH。

4）將準(zhǔn)備好的Rhod-5NAM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。37℃孵育20min-2h。

5）吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑如1 mM丙磺舒的緩沖液）清洗細(xì)胞1~2次，以去除殘留探針。

6）室溫再孵育30min以保證細(xì)胞內(nèi)AM的完全去酯化。

7）用適當(dāng)?shù)膬x器如激光共聚焦、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀，以及波長(zhǎng)Ex/Em=551/576 nm來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請(qǐng)?jiān)诟稍锏沫h(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請(qǐng)將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Rhod-5N, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Rhod-5N, AM第一次使用，建議儲(chǔ)存液現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝成單次用量，嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實(shí)驗(yàn)效果，盡量在短時(shí)間內(nèi)使用。

5.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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