Cell-Tracker細(xì)胞示蹤/細(xì)胞追蹤熒光探針專題

（Cell-Tracker Fluorescent Probes）

背景需求：

細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和定位研究需要專門(mén)的探針染料，首先必須要對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒性，還要同時(shí)具有多種熒光顏色可供選擇，以便與不同的儀器激光波長(zhǎng)和濾光片匹配并能與抗體標(biāo)記或其他細(xì)胞分析標(biāo)記探針共染色。

檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和定位的最簡(jiǎn)單方法就是使用具有膜通透性的探針染料進(jìn)入細(xì)胞并在加載后轉(zhuǎn)變?yōu)槟し峭ㄍ感缘漠a(chǎn)物。理想的細(xì)胞示蹤染料需要可存留于分裂多代后的子細(xì)胞中，但不會(huì)通過(guò)接觸轉(zhuǎn)移到相鄰細(xì)胞中。Cell-Tracker系列示蹤染料就是在這樣的背景下開(kāi)發(fā)而來(lái)：在工作濃度下保持穩(wěn)定且無(wú)細(xì)胞毒性，可穩(wěn)定存留在細(xì)胞中，且在生理 pH 條件下可發(fā)出明亮的熒光。Cell-Tracker示蹤熒光染料還具有多種發(fā)射光譜，可輕松與抗體標(biāo)記結(jié)合使用。

產(chǎn)品描述：

Cell-Tracker熒光探針是用來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、定位、增殖、遷移、趨化和侵襲的優(yōu)秀工具。

Cell-Tracker熒光探針能自由穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，在胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生成不具細(xì)胞膜滲透性的反應(yīng)產(chǎn)物。Cell-Tracker熒光探針（除了Cell-Tracker Deep Red）含有一氯甲基或溴甲基基團(tuán)，與巰基反應(yīng)，利用谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的催化作用。大多數(shù)細(xì)胞中谷胱甘肽含量很高（高達(dá)10mM），谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶普遍存在。Cell-Tracker Deep Red含一琥珀酰亞胺酯反應(yīng)基團(tuán)，與蛋白上的胺基反應(yīng)。一旦轉(zhuǎn)化為不可逆產(chǎn)物，這些產(chǎn)物幾次傳代都能良好的保留在活細(xì)胞中。在細(xì)胞群內(nèi)，染料只會(huì)轉(zhuǎn)移到子代細(xì)胞，不會(huì)轉(zhuǎn)移到鄰近細(xì)胞。

Cell-Tracker探針特地設(shè)計(jì)使其至少72h（典型有3~6代）能展示熒光，此染料表現(xiàn)出理想的示蹤特征：穩(wěn)定、工作濃度下無(wú)毒性、良好保留在細(xì)胞，且在生理pH下呈明亮熒光。

重要特征：

① 可快速加載標(biāo)記（通常 15 分鐘至 1 小時(shí)）

② 短期追蹤（一般 3-6代或72h）

③ 具有較強(qiáng)的耐光漂白/抗光淬滅特性

④ 熒光信號(hào)亮度適中

⑤ 信號(hào)分布于整個(gè)細(xì)胞

⑥ 適合熒光顯微鏡和HCS檢測(cè)

⑦ 提供多種發(fā)射光譜的Cell-tracker示蹤探針，適合多標(biāo)實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1）。

表1. Cell-Tracker熒光探針的光譜特征

染色示例：

Fig 1. Co-culture of CellTracker? labelled fibroblasts (green) and hESMPs (red) on bilayer membranes of either PHBV–PLA or PHBV–PCL. （Ref.：Frazer J. Bye et al. Development of bilayer and trilayer nanofibrous/microfibrous scaffolds for regenerative medicine. Biomater. Sci., 2013, 1, 942-951.

Fig 2. Measuring O2 exchange in RBCs using single-cell O2-saturating imaging. (C) Wild-type RBCs loaded with a mixture of Deep-Red and Green, showing fluorescence in oxygenated and deoxygenated microstreams. （Ref.：Sarah L. Richardson, Alzbeta Hulikova, Melanie Proven, Ria Hipkiss, Magbor Akanni, Noémi B. A. Roy, Pawel Swietach. Single-cell O2 exchange imaging shows that cytoplasmic diffusion is a dominant barrier to efficient gas transport in red blood cells.Proceedings of the National Academy of Sciences May 2020, 117 (18) 10067-10078;）

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常見(jiàn)問(wèn)題：

① 我的實(shí)驗(yàn)需要做細(xì)胞遷移研究（約4h），需要對(duì)細(xì)胞做熒光標(biāo)記，有推薦的產(chǎn)品?

比如：可選擇鈣黃綠素（Calcein AM，CAT NO. NBS2014）和二乙酸熒光素（FDA）（CAT NO. NBS0425）來(lái)做此用途。由于這些染料不會(huì)插入或共價(jià)結(jié)合到任何其它細(xì)胞成分，它們?cè)诎麅?nèi)的滯留時(shí)間比較短，因?yàn)槟承┘?xì)胞類(lèi)型可能極其活躍的將染料泵出細(xì)胞。像Cell-Tracker系列染料，包含要么溫和巰基反應(yīng)的氯甲基基團(tuán)要么胺基反應(yīng)的NHS基團(tuán)，使得探針共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)容物中，使得具更好的滯留效果。不管是哪種探針，用戶根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定在所用細(xì)胞類(lèi)型內(nèi)的滯留時(shí)間。

② 我的實(shí)驗(yàn)用Calcein AM來(lái)標(biāo)記細(xì)胞，但第二天成像，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有熒光信號(hào)，為什么？

鈣黃綠素（Calcein AM，CAT NO. NBS2014）是良好的細(xì)胞示蹤探針，以及常用的細(xì)胞質(zhì)染料。但，不會(huì)與胞內(nèi)內(nèi)含物結(jié)合，可能幾個(gè)小時(shí)就會(huì)被細(xì)胞泵出體外。鈣黃綠素在活細(xì)胞內(nèi)的滯留時(shí)間取決于不同細(xì)胞的內(nèi)在特征和培養(yǎng)條件。

如果要做長(zhǎng)期成像，更推薦使用具反應(yīng)性的細(xì)胞質(zhì)染料比如：CFDA SE或Cell-tracker示蹤探針。

③我的實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種細(xì)胞染色，一種用Cell-tracker green，一種用Cell-tracker Red，但看起來(lái)紅色與綠色染色細(xì)胞間有交叉干擾，為什么？

一種可能性是染料間存在光譜滲透。可通過(guò)檢查單一染色細(xì)胞，比如：對(duì)于紅色染料標(biāo)記細(xì)胞，用綠色熒光來(lái)檢測(cè)；對(duì)于綠色染料標(biāo)記細(xì)胞用紅色熒光來(lái)檢測(cè)，用另一種顏色的對(duì)應(yīng)濾片來(lái)成像檢測(cè)。通過(guò)對(duì)這些對(duì)照的觀察，發(fā)現(xiàn)有光譜滲透，可通過(guò)降低染料標(biāo)記濃度來(lái)降低染料亮度，或使用光譜間隔更大的染料重新標(biāo)記。如果不存在光譜滲透，還有一種可能性是染色后細(xì)胞并未充分清洗，使得某些未插入的染料保留在新的染色體系內(nèi)進(jìn)而標(biāo)記上其它細(xì)胞。增加清洗次數(shù)和延長(zhǎng)時(shí)間有可能改變這個(gè)問(wèn)題。