Tetramethylrhodamine Methyl Ester (TMRM)

產(chǎn)品簡介：

帶正電荷的羅丹明染料（比如羅丹明酯）選擇性定位在線粒體，因此，普遍用來標記活細胞線粒體。除了選擇性標記線粒體外，與JC-1一樣，四甲基羅丹明甲酯（Tetramethylrhodamine Methyl Ester,TMRM）廣泛用來測定線粒體膜電位。TMRM具細胞膜滲透性，聚集在活線粒體（完整膜電位）上。如果細胞健康且線粒體發(fā)揮功能，發(fā)出明亮的熒光信號。一旦線粒體膜電位喪失，TMRM不再累積，熒光信號減弱或消失。TMRM信號可用熒光顯微鏡、流式細胞儀、細胞分選、高通量篩選和高內(nèi)涵細胞成像分析進行檢測。       

TMRM具有以下特征：①適用于線粒體膜電位的活細胞動態(tài)學(xué)研究，不適用于固定細胞。②可用RFP/TRITC濾片設(shè)置觀察，最大激發(fā)和發(fā)射波長是548/574nm。③與綠色、深紅色、紫色和藍色發(fā)射探針兼容，比如：GFP、DAPI、Hoechst，Lysotracker deep red，做多重染色。

產(chǎn)品特性:

1） CAS NO.：115532-50-8

2） 化學(xué)名：3,6-bis(dimethylamino)-9-[2-(methoxycarbonyl)phenyl]-xanthylium, perchlorate

3） 同義名：Tetramethylrhodamine methyl ester, perchlorate 四甲基羅丹明甲酯高氯酸鹽；TMR methyl ester TMR甲酯；

4） 分子式：C25H25ClN2O7

5） 分子量：500.93

6） Ex/Em：549/574nm

7） 純度：≥95%

8） 溶解性：溶于DMSO

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，至少一年有效。 

產(chǎn)品使用：

1.儲存液制備

1.1將低溫保存的產(chǎn)品置于室溫回溫至少20min（此步非常重要，請勿忽略操作），低速離心片刻使粉末沉至管底。

1.2對于25mg粉末，往瓶內(nèi)加入5ml高質(zhì)量無水DMSO配制成10mM儲存液；由于TMRM的使用濃度比較低，可再配制一個中間儲存濃度（比如：100μM），比如：取10μl TMRM（10mM）加入990μl DMSO，充分混勻后，即得到100μM的中間儲存濃度。

2.工作液制備

于正式實驗前，用無血清細胞培養(yǎng)基稀釋母液到適宜的工作濃度，比如：100nM。根據(jù)不同的實驗用途和細胞類型，TMRM的工作濃度范圍一般在20nM~1000nM，初次使用務(wù)必優(yōu)化獲得最佳工作濃度。工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.染色步驟（以熒光成像為例）

注①：對于熒光成像分析，常用的TMRM工作濃度范圍是50-200nM。

注②：如果需測定某藥物對膜電位的作用，需提前處理細胞，再用探針進行后續(xù)檢測。同時需要設(shè)置藥物未處理組和藥物處理組。

注③：如果需要陽性對照，可選擇FCCP或CCCP，這兩種化合物都是解偶聯(lián)劑，能夠降低線粒體膜電位，從而防止TMRM染色。

3.1 培養(yǎng)細胞。

3.2去除培養(yǎng)基，用生理緩沖液比如PBS清洗1-2次。

3.3 加入新鮮配好的工作液完全覆蓋細胞。

3.4于37℃避光孵育15~45min。

3.5【可選】為了增高靈敏度，用PBS或類似緩沖液清洗細胞1~2次。

3.6熒光成像。對于熒光顯微鏡，用能夠觀察Ex/Em=548/573nm的濾片來進行觀察。

染色示例：

Ref：Joshi DC, Bakowska JC. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. J Vis Exp. 2011 May 23;(51):2704. doi: 10.3791/2704. PMID: 21654619; PMCID: PMC3143685.

Figure 1. Assessment of mitochondrial membrane potential and ROS levels in live rat cortical neurons. (A) Representative fluorescence image of cortical neurons loaded with TMRM. After scanning the baseline TMRM fluorescence, neurons were treated with the protonophore FCCP (1 μM). To the right is a pseudocolor intensity bar of TMRM fluorescence with bright yellow and black representing maximum and minimum intensity, respectively. The loss of TMRM fluorescence from the mitochondrial regions indicates the collapse of ΔΨm upon FCCP treatment (panel B). The quantitative representation of change in TMRM fluorescence intensity at different time points before and after FCCP treatment is shown in panel C. 

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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